Beginnen Sie damit, einen Magnetabscheider an seinem Ständer anzubringen. Schließen Sie eine Auswahlsäule an den Magnetabscheider an und platzieren Sie ein 70-Mikron-Zellsieb auf der Auswahlsäule. Platzieren Sie ein 50-Milliliter-Röhrchen unter der Auswahlsäule, um den Durchfluss aufzufangen.
Sobald die Gehirnzellen der Maus eine Konfluenz von 80 % erreicht haben, saugen Sie das Medium ab und spülen Sie die Zellen mit PBS. Fügen Sie 0,25 % Trypsin hinzu, um die Adhärenzzellen abzulösen, und inkubieren Sie fünf Minuten lang bei 37 Grad Celsius. Fügen Sie dann einen Stopppuffer hinzu.
Zentrifugieren Sie die Zellsuspension fünf Minuten lang bei 300 g und entfernen Sie den Überstand. Für die Antikörperfärbung werden 10 an die sieben Zellen in 100 Mikroliter PBS resuspendiert. Dann 10 Mikroliter LYVE-1 Antikörperlösung zugeben und gründlich mischen.
Die Mischung 30 Minuten im Dunkeln bei vier Grad Celsius inkubieren. Nach der Inkubation zentrifugieren Sie die Zellen und entsorgen Sie den Überstand. Dann spülen Sie die Zellen, indem Sie einen Milliliter PBS hinzufügen und fünf Minuten lang bei 300 g zentrifugieren.
Für die Markierung von Mikroperlen wird das Pellet in 100 Mikroliter PBS und 20 Mikroliter Mikroperlen resuspendiert. Quellen lassen und 30 Minuten im Dunkeln bei vier Grad Celsius inkubieren. Zentrifugieren Sie dann die Suspension und waschen Sie das Pellet mit einem Milliliter PBS.
Zentrifugieren Sie das Pellet erneut und resuspendieren Sie es in vier Milliliter PBS, um einen magnetischen negativen Ausschluss zu erzielen. Führen Sie die Zellsuspension durch ein 70-Mikron-Sieb, um Klumpen zu beseitigen. Bereiten Sie die Auswahlsäule vor, indem Sie sie mit drei Millilitern PBS spülen.
Fügen Sie dann die Zellenaufhängung in die Auswahlspalte ein. Waschen Sie die Säule mit drei Millilitern PBS und sammeln Sie LYVE-1-negative Zellen in einem 50-Milliliter-Röhrchen. Für die magnetische Positivselektion pipettieren Sie sechs Milliliter PBS in die Auswahlspalte.
Spülen Sie dann die magnetisch markierten Zellen, indem Sie den Kolben fest in die Selektionssäule drücken, um LYVE-1-positive LLECs zu erhalten. Als nächstes zentrifugieren Sie die positive Zellsuspension und entfernen den Überstand. Platte 10 bis zu den fünften Zellen pro Quadratzentimeter in einen T25-Kolben mit fünf Millilitern Nährmedium.
Pflegen Sie die Kultur, indem Sie jeden zweiten Tag 50 % des Mediums austauschen. Wenn die Zellen eine Konfluenz von 80 % erreicht haben, trennen Sie sie wie zuvor gezeigt, bevor Sie die Zellpassage durchführen. Die Durchflusszytometrie-Analyse ergab, dass sich der Prozentsatz der LYVE-1-positiven Zellen in der zweiten Passage nicht signifikant von der dritten Passage nach MACS unterschied, was auf eine Reinheit von mehr als 95 % hindeutet.
LYVE-1-positive Zellen exprimierten F48 und den von Blutplättchen abgeleiteten Wachstumsfaktor beta nicht, wodurch LLECs effektiv von Makrophagen und Fibroblasten unterschieden wurden. Leptomeningeale Zellen vor MACS zeigten eine heterogene Morphologie, die von runden Kugeln bis hin zu verschmolzenen Faserformen reichte. Nach MACS wiesen LLECs jedoch typische endothelähnliche Merkmale wie Spindel- und Kopfsteinpflasterformen auf.
