Beginnen Sie mit der Verdünnung der Humansera, indem Sie fünf Mikroliter der Serumprobe mit 120 Mikrolitern Assay-Puffer in einer 96-Well-Platte mischen. Verdünnen Sie auf das weitere Achtfache, indem Sie 10 Mikroliter der ursprünglichen Verdünnung mit 70 Mikrolitern Assay-Puffer mischen. Bereiten Sie nun 100 Mikroliter der Kügelchenmischung vor, die Antigen-gekoppelte Zielkügelchen enthält.
Als nächstes wird die vorbereitete Kügelchenmischung in 2,4 Milliliter des Assay-Puffers in einem Falcon-Röhrchen verdünnt. Beginnen Sie mit der Seruminkubation, indem Sie 25 Mikroliter der Kügelchensuspension in die dafür vorgesehenen Vertiefungen pipettieren. Geben Sie 25 Mikroliter 200-fach verdünntes Serum in die Vertiefungen mit der Kügelchensuspension.
Decken Sie die 96-Well-Reaktionsplatte mit einer Mikrotiterplattendichtung ab. Anschließend die Platte mit Perlen auf einem Tellerschüttler inkubieren. Entfernen Sie nach der Inkubation die 96-Well-Reaktionsplatte aus dem Plattenschüttler.
Legen Sie die Platte in eine magnetische Plattenscheibe und entfernen Sie die selbstklebende Plattendichtung. Als nächstes waschen Sie die Perlen dreimal mit 100 Mikrolitern Waschpuffer und saugen nach dem letzten Waschschritt das endgültige Waschvolumen aus den Perlen ab. Für die erste Antikörper-Inkubation bereiten Sie zunächst eine frische IgG- und IgM-Doppeldetektions-Reagenzienmischung in Assay-Puffer vor.
Pipettieren Sie 30 Mikroliter des Detektionsreagenzes in jede dafür vorgesehene Vertiefung und decken Sie dann die 96-Well-Reaktionsplatte mit einer Mikrotiterplattenversiegelung ab. Die Platte auf einem Plattenschüttler 45 Minuten bei 20 Grad Celsius bei 750 Umdrehungen pro Minute inkubieren. Legen Sie die Platte nach der Inkubation in eine magnetische Plattenscheibe und entfernen Sie die Klebeplattendichtungspipette mit 30 Mikrolitern verdünntem BV421-markiertem Striptavidin in jede Reaktion, nachdem Sie die Platten wie zuvor gewaschen haben.
Legen Sie dann die versiegelte Platte für die anschließende Inkubation auf einen Plattenschüttler. Sobald die Inkubation abgeschlossen ist, waschen Sie die Platte und resuspendieren Sie die Kügelchen in den Vertiefungen mit dem Waschpuffer auf ein Endvolumen von 100 Mikrolitern. Um die Ergebnisse zu analysieren, bedecken Sie die 96-Well-Reaktionsplatte mit einer Mikrotiterplattendichtung.
Als nächstes wird die abgedeckte Platte drei Minuten lang bei 20 Grad Celsius bei 1000 Umdrehungen pro Minute auf einem Plattenschüttler inkubiert. Übertragen Sie die Platte vom Schüttler auf das Durchflussanalysatorgerät mit zwei Reportern. Beurteilen Sie abschließend die mittlere Fluoreszenzintensität (MFI) der Probe gemäß den Anweisungen des Herstellers.
Die Spearman-Korrelationsanalyse für drei repräsentative Borrelien-Antigene zeigte eine einheitliche Reproduzierbarkeit der MFI-Werte beim Nachweis von Anti-Borrelien-Antikörpern in humanen Seren. Der Dual-Reporter-Assay zeigte eine gute Reproduzierbarkeit von Assay zu Assay mit hoher Präzision zwischen den Assays, die durch Levey-Jennings-Diagramme demonstriert wurde. Bei Probenverdünnungen von 100-fach bis 12.800-fach waren die Verdünnungskurven für den IgM-Nachweis und den IgG-Nachweis für beide Geräte ähnlich.
Die MFI-Werte waren beim Einzelberichterinstrument etwas höher.
