Um eine SPR für VHL-MZ1-Wechselwirkungen durchzuführen, aktivieren Sie zunächst den Streptavidin-Chip gemäß den Anweisungen des Herstellers. Um die höchste Konzentration zu erreichen, fügen Sie dem MZ1 einen DMSO-freien Puffer hinzu, um eine DMSO-Konzentration von 2 % zu gewährleisten. Pipettieren Sie nun 50 Mikroliter der Lösung mit der höchsten Konzentration in eine Vertiefung, die 100 Mikroliter des laufenden Puffers enthält. Mischen Sie gründlich, um die zweithöchste Konzentration einzustellen.
Dann 50 Mikroliter der Lösung in die nächsten 100 Mikroliter Laufpuffer überführen, gut mischen, um die dritthöchste Konzentration herzustellen, und so weiter. Verwenden Sie selbstklebende transparente Kunststofffolien, die mit Polypropylen-Mikrotiterplatten kompatibel sind, um die Platte abzudecken. Initiieren Sie die SPR mit dem Multi-Cycle-Setup.
Stellen Sie den Modus auf hohe Leistung, die Kontaktzeit auf 120 Sekunden, die Dissoziationszeit auf 300 Sekunden und die Durchflussrate auf 50 Mikroliter pro Minute ein. Verwenden Sie die vom Gerätehersteller bereitgestellte Auswertesoftware, um die Datenanalyse durchzuführen. Um eine SPR für den ternären VHL-MZ1-BRD4-Komplex durchzuführen, aktivieren Sie zunächst das Streptavidin.
Injizieren Sie VHL-Lösung, um sie auf ca. 100 Resonanzeinheiten zu immobilisieren. Für die Negativkontrolle nur mit BRD4 ist die höchste Konzentration von 25 Mikromolar im Laufpuffer mit einem Volumen von 200 Mikrolitern herzustellen. Zu den nächsten vier Vertiefungen werden jeweils 160 Mikroliter zweimikromolares BRD4 hinzugefügt.
40 Mikroliter aus der Vertiefung A5 in die Vertiefung A4 überführen. Pipettieren Sie dann die Vertiefung, um sie gründlich zu mischen. In ähnlicher Weise werden 40 Mikroliter aus der Vertiefung A4 in die Vertiefung A3 überführt und dieser Vorgang fortgesetzt, bis A1 erreicht ist. Für die ternäre Komplexbildung mit MZ1 und BRD4 pipettieren Sie 196 Mikroliter 25,5-mikromolare BRD4-Lösung. Dazu werden vier Mikroliter 20-mikromolares MZ1 in 100%iger DMSO-Lösung hergestellt.
Pipettieren Sie 160 Mikroliter BRD4 an zwei Mikromol im laufenden Puffer zu den nächsten vier Vertiefungen auf der linken Seite. Als nächstes werden 40 Mikroliter aus der Vertiefung B5 in die Vertiefung B4 überführt und mit der Pipette gründlich vermischt. Fahren Sie mit dem Umfüllen der Lösung aus jeder Vertiefung bis B1 fort. Führen Sie nun den SPR mit einer Kontaktzeit von 100 Sekunden, einer Dissoziationszeit von 720 Sekunden und einer Durchflussrate von 50 Mikrolitern pro Minute in den Single-Cycle-Setup.
Die Charakterisierung des VHL-MZ1 Binärkomplexes und des VHL-MZ1-BRD4 ternären Komplexes wurde durchgeführt. Es wurde eine positive Kooperativität beobachtet. Die Charakterisierung des Cereblon-, PROTAC- und PPM1D-Systems wurde mittels SPR durchgeführt.
PPM1D-Experimente verwenden einen Nickel-NTA-Chip, und die Chipoberfläche wird nach jeder Verbindungsinjektion regeneriert. BRD-2512, das nur an Cereblon bindet, und BRD-4761, das nur an PPM1D bindet, zeigen eine vernachlässigbare Bindungsreaktion. BRD-5110 induziert die Bildung eines ternären Komplexes zwischen PPM1D und zeigt einen Hook-Effekt bei hohen Konzentrationen von Verbindungen.
