Bereiten Sie zunächst ein organoides Kulturmedium vor, das 10 mikromolare Y-27632 und 2,5 mikromolare CHIR-99021 enthält. Nachdem Sie das ECM auf den Gut-on-a-Chip aufgetragen haben, trennen Sie den Auslassschlauch vom oberen Mikrokanal, während Sie den Bypass-Schlauch des oberen Mikrokanals offen lassen. Sichern Sie mit einer Binderklammer sowohl den Einlass als auch den Auslass des unteren Mikrokanals.
Geben Sie mit einer P100-Mikropipette 20 Mikroliter der Zellsuspension in das Auslassloch des oberen Mikrokanals. Befestigen Sie den Bypass- und Einlassschlauch des oberen Mikrokanals mit Binderclips. Befestigen Sie den Auslassschlauch wieder an der Auslassöffnung des oberen Mikrokanals und stellen Sie sicher, dass der Schlauch während des gesamten Prozesses offen bleibt.
Sobald dies erledigt ist, befestigen Sie den Auslassschlauch des oberen Mikrokanals nach und nach mit einer Bindeklammer. Überprüfen Sie dann unter dem Mikroskop, ob die Zellen gleichmäßig über den oberen Mikrokanal verteilt sind. Stellen Sie das Gut-on-a-Chip-Gerät und einen befeuchteten Kohlendioxid-Inkubator auf 37 Grad Celsius.
Verbinden Sie die Spritze, die am oberen Mikrokanal des Chips befestigt ist, mit einer Spritzenpumpe, die sich in einem Inkubator befindet. Stellen Sie die Durchflussmenge auf 30 Mikroliter pro Stunde ein und starten Sie den kontinuierlichen Durchfluss des Sitzmediums für den oberen Mikrokanal. Lassen Sie während dieser Zeit den unteren Mikrokanal eingespannt.
Ersetzen Sie das Medium am Tag nach dem Setzen durch ein organoides Nährmedium, das nur A-83-01 enthält. Sobald die Monoschicht für den oberen Mikrokanal etabliert ist, wird der kontinuierliche Sitzmittelfluss zum unteren Mikrokanal eingeleitet. Als nächstes wird Organoid-Kulturmedium sowohl in den oberen als auch in den unteren Mikrokanal eingebracht, um die Entwicklung der dreidimensionalen Morphogenese im Chip einzuleiten.
Erhöhen Sie die Durchflussrate auf 50 Mikroliter pro Stunde, um eine reine Spannung von 0,02 Diner pro Quadratzentimeter im Gut-on-a-Chip-Design zu erreichen. Unter Verwendung eines computergesteuerten Bioreaktors werden die auf einem Gut-on-a-Chip-Gerät kultivierten Zellen zwei bis drei Tage lang mit einer zyklischen Spannung von 10 % und einer Frequenz von 0,15 Hertz behandelt, um eine dreidimensionale Morphogenese zu ermitteln. Nach sechs bis neun Tagen mit mittlerem Durchfluss wurde eine gelegentliche Häufung der dreidimensionalen Morphogenese von intestinalen Epithelzellen des Hundes im gesamten Mikrokanal beobachtet.
Die Immunfluoreszenzfärbung untersuchte die dreidimensionale Struktur von Organoid-abgeleiteten Monoschichten und zottenartigen Strukturen in mikrofluidischen Chips. Die mit TEER gemessene intestinale Barrierefunktion zeigte am fünften Tag der Kultur stabile TEER-Werte.
