Beginnen Sie mit der Kultivierung der Ösenproben, die aus Mäusen mit normaler Fettdiät oder fettreicher Diät isoliert wurden, über Nacht bei 37 Grad Celsius. Entwerfen Sie die gewünschten Versuchsbedingungen für die Studie. Für jede Versuchsbedingung werden mit einer Pipette 100 Ösen in eine sechs Zentimeter lange Petrischale mit zwei Millilitern Ösenmedium aufgenommen.
Um eine Mitophagie zu induzieren, behandeln Sie die Ösen in den entsprechenden Petrischalen drei Stunden lang mit zwei Mikrolitern 250 nanomolaren Valinomycin-Brühe. Isolieren Sie die Ösen und geben Sie mit einer Pipette die Ösen aus jeder Petrischale in ein separates Mikrozentrifugenröhrchen. Drehen Sie dann die Ösen bei 350 g für eine Minute bei 10 Grad Celsius und entsorgen Sie den Überstand mit einer Pipette.
Waschen Sie die erhaltene Probe zweimal mit einem Milliliter PBS. Schleudern Sie die Probe zwischen den Waschgängen und verwerfen Sie den Überstand, wie zuvor gezeigt. Um die Ösen in einzelne Zellen zu dissoziieren, werden 500 Mikroliter 0,05%iges Trypsin, das auf 37 Grad Celsius vorgewärmt wurde, in ein Probenröhrchen gegeben.
Pipettieren Sie den Inhalt des Röhrchens wiederholt auf und ab, bis die Ösen sichtbar verteilt sind. Fügen Sie sofort einen Milliliter vorgewärmtes Ösenmedium hinzu, um Trypsin zu neutralisieren. Schleudern Sie die Proben bei 500 G fünf Minuten lang bei 10 Grad Celsius.
Entfernen Sie den Überstand vorsichtig, ohne das Pellet zu stören. Anschließend werden die Proben zweimal mit Ösenfließmedium gewaschen. Die Zellproben können nun für die durchflusszytometrische Analyse der Betazell-Mitophagie gefärbt werden.
