Fahren Sie mit der durchflusszytometrischen Analyse der Betazell-Mitophagie fort, wobei eine Einzelzellsuspension von etwa 100 isolierten Spiegelinseln vorbereitet wird, die jeder gewünschten zu untersuchenden Versuchsbedingung entsprechen. Zuerst werden die Inselproben für jede Bedingung in 500 Mikroliter Inselflussmedium resuspendiert. Geben Sie 0,25 Mikroliter MtPhagy-Stamm in Röhrchen, die für die Aufnahme des MtPhagy-Farbstoffs vorgesehen sind.
In ähnlicher Weise werden 0,25 Mikroliter TMRE-Material und Fluozin-3-AM-Material in die jeweils dafür vorgesehenen Röhrchen gegeben. Wickeln Sie die Röhrchen in Aluminiumfolie ein und wirbeln Sie jedes Röhrchen fünf Sekunden lang bei niedriger Geschwindigkeit vor, um den Inhalt zu mischen. Anschließend die Röhrchen bei 37 Grad Celsius für 30 Minuten inkubieren.
Nach der Hälfte der Inkubation wird jede Probe fünf bis 10 Sekunden lang bei niedriger Geschwindigkeit vortexen. Nach der Inkubation zentrifugieren Sie die Röhrchen bei 350 g für eine Minute bei 10 Grad Celsius. Verwerfen Sie den Überstand.
Und resuspendieren Sie die Proben in 500 Mikroliter Inselflussmedium. Geben Sie DAPI in die Mikrozentrifugenröhrchen mit Proben, die eine DAPI-Behandlung erfordern. Zentrifugieren Sie erneut und verwerfen Sie den Überstand, wie zuvor gezeigt.
Resuspendieren Sie den Rückstand in 500 Mikroliter Inselflussmedium. Zum Schluss legen Sie die Proben auf Eis und fahren dann mit der Durchflusszytometrie fort. Passen Sie die Spannungen für Durchlassstreuung oder FSC und Seitenstreuung oder SSC an, um sicherzustellen, dass sich die Zellpopulationen in der Mitte des Streudiagramms befinden.
Um Multipletts auszuschließen, an einem rechteckigen Gatter auf FSC-Höhe versus FSC-Breite, gefolgt von SSC-Höhe versus SSC-Breite. Passen Sie die Spannungen und die Kompensation für DAPI an, um nach lebenden Betazellen zu filtern. Setzen Sie Fluoreszenz-Gates für jedes verwendete Fluorophor basierend auf der ungefärbten RFD-Probe.
Sobald die Gatter eingerichtet sind, werden 10.000 Ereignisse pro Stichprobe erfasst. Betazellen mit hoher Auslastung der Mitophagie wurden definiert als die Fluozin-Population mit hoher MtPhagie, hoher TMRE, niedriger Population im dritten Quadranten oder Q3. Basale und Valinomycin-induzierte Mitophagie-Spiegel wurden sowohl auf RFD- als auch auf HFD-Inseln charakterisiert.
