Um die Mitophagie in murinen Pankreas-Betazellen mit dem genetisch kodierten Mitophagie-Reporter zu untersuchen, werden Pankreasinseln, die aus Wildtyp- und Mt-Keima-Mäusen isoliert wurden, über Nacht bei 37 Grad Celsius kultiviert. Am nächsten Tag werden 100 Inselchen in eine sechs Zentimeter lange Petrischale gegeben, die zwei Milliliter Inselmedium für jede in diesem Protokoll verwendete Versuchsbedingung enthält. Als nächstes werden die Ösen in einzelne Zellen dissoziiert und mit FluoZin-3-AM und DAPI gefärbt, wie zuvor für den auf Mt-Phagy-Farbstoffen basierenden Ansatz demonstriert wurde.
Fahren Sie dann mit der durchflusszytometrischen Analyse der Proben fort. Passen Sie die Durchlassstreuung (FSC) und die Seitenstreu- oder SSC-Spannung an, um eine gleichmäßige Verteilung der Zellen in einem SSCA- und FSCA-Diagramm zu erreichen. Um einzelne Zellen auszuwählen und Multipletts auszuschließen, fügen Sie ein rechteckiges Gatter für die FSC-Höhe im Vergleich zur FSC-Breite hinzu, gefolgt von SSC-Höhe im Vergleich zur SSE-Breite.
Die Multipletts werden aufgrund ihrer höheren Signalbreite ausgeschlossen. Richten Sie dann ein DAPI-negatives Gatter ein, um tote Zellen auszuschließen. Richten Sie danach positive FluoZin-3-AM-Gatter ein, um nach lebenden Betazellen zu filtern.
Richten Sie ein Dreiecks-Gating-Schema mit der Mt-Keima-positiven Probe ein, um saure und neutrale Zellpopulationen zu identifizieren. Sobald die Primär- und Fluoreszenzgatter etabliert sind, wird der Mitophagiefluss anhand von basalen und Valinomycin-induzierten Veränderungen der Mt-Keima-Fluoreszenz beurteilt.
