Beginnen Sie mit dem Auftauen der gefrorenen gelösten Stoffträger oder SLC-Zellpellets in einem Wasserbad bei Raumtemperatur. Bereiten Sie den Solubilisierungspuffer vor, indem Sie 135 Milliliter Basenpuffer und drei Protease-Inhibitor-Cocktail-Tabletten kombinieren. Sobald die Tabletten aufgelöst sind, resuspendieren Sie das Pellet im Solubilisierungspuffer.
Dann wird Deaminase zugegeben und die Suspension in einen eisgekühlten Homogenisator überführt. Homogenisieren Sie die Lösung, indem Sie den Kolben etwa 20 Mal auf und ab bewegen, wobei der Homogenisator auf Eis bleibt. Als nächstes wird die Reinigungsmittellösung auf 1 % Endkonzentration zugegeben.
Die Solubilisierungsmischung in ein konisches 50-Milliliter-Röhrchen überführen und langsam bei vier Grad Celsius drehen. Nach einer Stunde zentrifugieren Sie die Mischung und sammeln Sie den Überstand. Äquilibrieren Sie ein Bettvolumen von vier bis sechs Millilitern Streptokokken-Taktinharz mit dem Basispuffer.
Dann wird dem gelösten Überstand äquilibriertes Harz hinzugefügt und zwei Stunden lang bei vier Grad Celsius gedreht. Gießen Sie die Lösung auf eine Schwerkraft-Durchflusssäule und lassen Sie die Lösung durchfließen. Waschen Sie das Harz mit dem 30-fachen Bettvolumen Streptokokken-Waschpuffer in drei gleichen Schritten.
Als nächstes fügen Sie drei bis fünf Milliliter Illusionspuffer hinzu und inkubieren Sie 15 Minuten lang, bevor Sie die Eluute sammeln. Messen Sie die Proteinkonzentration durch UV-absorbierende Spektroskopie. Kombinieren Sie die gewünschten Illusionsfraktionen und fügen Sie 3C-Protease hinzu.
Drehen Sie das Rohr über Nacht langsam bei vier Grad Celsius. Am nächsten Tag werden zwei bis vier Milliliter Bettvolumen des Kobaltmetall-Affinitätsharzes mit SEC-Puffer ausgeglichen. Geben Sie das äquilibrierte Kobaltmetall-Affinitätsharz in die 3C-Reaktionsmischung über Nacht und drehen Sie es bei vier Grad Celsius.
Nach einer Stunde wird die Lösung in eine Schwerkraft-Durchflusssäule gegossen und der Durchfluss aufgefangen. Konzentrieren Sie den Durchfluss in einem 100-Kilodalton-Cutoff-Zentrifugalfilter, indem Sie ihn bei 3000 g bei vier Grad Celsius drehen. Äquilibrierte Dextran-Argos-basierte SEC-Säule mit SEC-Puffer.
Injizieren Sie die Probe in die Probenschleife und führen Sie das SEC-Programm mit einer Durchflussrate aus, bei der der Säulendruck unter den Spezifikationen des Säulenherstellers liegt. Sammeln Sie mit einem Fraktionssammler 300 Mikroliterfraktionen über den gesamten SEC-Lauf. Messen Sie nach dem Pooling der Peak-Fraktionen die Absorption bei 280 Nanometern.
Anschließend werden die Proben in einem 100-Kilo-Cutoff-Filter auf das erforderliche Volumen konzentriert. Die anfängliche Expression des SLC-Proteins in kleinem Maßstab wurde mittels SDS-Seitenelektrophorese analysiert. Die Fluoreszenzmikroskopie eines GFP-markierten SLC bestätigte die Proteinlokalisation, die spezifisch für die Plasmamembran mit signifikanter intrazellulärer Akkumulation ist.
Chemisch und strukturell homogenes Protein ergab während der Größenausschlusschromatographie einen einzelnen monodispersen A280-Peak.
