Schneiden Sie zunächst mit einer Schere ein kleines Stück Linsenpapier ab und legen Sie es in eine Petrischale. Als nächstes gießt du das Formalin mit dem fixierten Gehirn und der Wirbelsäule, die von einer Maus isoliert wurden, in einen Trichter, der mit Filterpapier ausgekleidet ist. Übertragen Sie das Gehirn und die Wirbelsäule in eine leere Petrischale.
Verwende ein Skalpell, um das Gehirn in sechs koronale Teile zu teilen. Übertragen Sie die Gehirnproben mit einer Pinzette auf eine Hälfte des Linsenpapiers in der Petrischale. Schneiden Sie das Rückenmark mit dem Skalpell in drei Stücke und schneiden Sie dann das sakrale Wirbelsäulenstück am kaudalen Ende durch, bis das Rückenmark sichtbar wird.
Hebe die Brustwirbelsäule mit der nicht-dominanten Hand an. Nehmen Sie die Adson-Pinzette mit fest geschlossenen Zähnen in der dominanten Hand und schieben Sie das Ende mit einer sanften Drehbewegung vorsichtig in die kleinere Öffnung der Wirbelsäule. Ziehen Sie dann mit einer Pinzette vorsichtig das entstehende Rückenmark aus der Säule heraus und legen Sie das Nabelschnurstück in die Petrischale mit dem Linsenpapier.
Teilen Sie mit einem Skalpell drei Rückenmarksstücke in kleinere Querschnittsstücke. Ordnen Sie diese Stücke auf der gleichen Hälfte des Linsenpapiers an, in der sich die Gehirnstücke befinden. Falten Sie das Linsenpapier, um die Taschentücher zu befestigen, und legen Sie es in eine beschriftete Kassette.
Füllen Sie die Kassette in ein Probenglas mit Formalin. Nach der Inkubation wird die Kassette aus dem Probenbehälter in das erste Formalinbad im automatischen Gewebeprozessor überführt und der Prozessor über Nacht laufen gelassen. Nehmen Sie am nächsten Tag die Kassetten aus dem Gewebeprozessor und geben Sie sie in die warme Warmhaltekammer der Paraffineinbettstation, gießen Sie das Paraffinwachs, um den Boden der Form zu bedecken.
Legen Sie mit einer feinen Pinzette Querschnittsstücke des Gehirns und des Rückenmarks in das Paraffin am Boden der Form. Legen Sie die Form für einige Sekunden auf die Kühlfläche, um das Gehirn und die Proben an Ort und Stelle zu fixieren. Schieben Sie die Form zurück auf die erhitzte Oberfläche und füllen Sie sie bis zum Rand mit heißem Paraffin.
Setzen Sie den Kassettendeckel mit der Proben-ID auf die Form. Gießen Sie Paraffin auf den Kassettendeckel. Bringen Sie die Form in die Kühlstation, damit das Wachs aushärten kann.
Sobald die Blöcke vollständig abgekühlt sind, befestigen Sie den Block auf einem Rotationsmikrotom. Schneiden Sie die Blöcke ab und schneiden Sie von jedem Paraffinblock fünf Mikrometerabschnitte ab. Bringen Sie das Paraffinband in ein 42 Grad Celsius warmes Wasserbad.
Beobachten Sie den Rückenmarksabschnitt in vier Quadranten und bewerten Sie das Vorhandensein von Demyelinisierungsläsionen in jedem Quadranten. Dieser Abschnitt hat einen Score von vier, da in allen vier Quadranten Läsionen vorhanden sind. Dieser Abschnitt wird mit eins bewertet, da sich die Läsionen nur in einem Quadranten befinden.
Die CD45-Färbung weist auf das Vorhandensein von Leukozyten in Läsionen hin. Neue Läsionen enthalten im Vergleich zu älteren Läsionen viele CD45-Zellen. Im Gegensatz dazu können neue Läsionen im Vergleich zu älteren Läsionen weniger SMI-32-positive Axone enthalten.
Die Mäuse in der Wildtyp-Gruppe entwickelten eine schwere EAE mit vollständiger Lähmung. Während die OGR1-KO-Gruppe eine milde Erkrankung entwickelte. Dieser Unterschied im klinischen Score korrespondierte mit Variationen der submeningealen Demyelinisierungsläsionen in Prozent der im Rückenmark gefärbten Myelinfläche, außerdem unterschied sich die prozentuale Myelinfraktion signifikant zwischen OGR1- und Wildtyp-Mäusen und korrelierte mit dem kumulativen EAE-Score.
Bei der EAE ist die Entzündung im Gehirn vor allem im Kleinhirn und im Hirnstamm lokalisiert. Weitere Entzündungsbereiche können im Gehirn auftreten, einschließlich in den Hirnhäuten, in der Nähe der Ventrikel und in anderen Bahnen der weißen Substanz wie dem Sehnerv und dem Corpus callosum. Serum-Neurofilament-Licht, das mit einem kleinen Molekül-Array-Assay gemessen wurde, detektierte höhere Serum-Neurofilament-Lichtspiegel bei Mäusen mit EAE im Vergleich zu gesunden Mäusen, und diese erhöhten Werte korrelierten mit der Dichte von SMI-32-positiv im Rückenmark.
