Reviving the Cryopreserved Day 32 hESC-Derived Photoreceptor Progenitors

Beginnen Sie damit, PRDM in ein Wasserbad zu geben, das auf 37 Grad Celsius eingestellt ist. Entfernen Sie ein Kryoröhrchen mit Photorezeptor-Vorläuferzellen aus dem Tag 32 hESC aus flüssigem Stickstoff und bewahren Sie es auf Trockeneis auf. Anschließend das Kryoröhrchen in einem Wasserbad bei 37 Grad Celsius für drei bis fünf Minuten auftauen.

Resuspendieren Sie die Zellen in einem Milliliter PRDM. Zentrifugieren Sie sie vier Minuten lang bei 130 g Nachdem Sie den Überstand entfernt haben, suspendieren Sie das Pellet erneut in einem Milliliter PRDM. Um die Zellen zu zählen, nehmen Sie 10 Mikroliter der Zellsuspension und mischen Sie sie mit 0,2 % Trypanblau gemäß den Anweisungen des Herstellers.

Pipettieren Sie die Zellmischung in den Objektträger der Zellzählkammer und bestimmen Sie die Zellzahl und Viabilität mit einem automatischen Zellzähler. Wenn die Zellviabilität über 70 % liegt, zentrifugieren Sie die verbleibende Zellsuspension vier Minuten lang bei 130 g. Entfernen Sie den Überstand und suspendieren Sie das Zellpellet erneut in PRDM für die Transplantation.

Mit einer 10-Mikroliter-Pipettenspitze die Zellklumpen im Mikrofugenröhrchen neu suspendieren, bis keine Klumpen mehr sichtbar sind. Füllen Sie die Suspension in eine 33-Gauge-Injektionsspritze und bestätigen Sie die Extrusion der Zelllösung durch die Nadel.