Nehmen Sie zunächst eine betäubte Maus und geben Sie einen Tropfen 1% Tropicamid und 2,5% Phenylephrin in das Auge, um die Pupille zu erweitern. Tragen Sie dann ein ophthalmisches Gel auf die Hornhaut auf, um Trockenheit und anästhesiebedingten Katarakten zu verhindern. Als nächstes stellen Sie ein aufrechtes Operationsmikroskop mit direktem Strahlengang in einer sterilen Umgebung auf, um die subretinale Injektion durchzuführen.
Um die 10-Mikroliter-Glasspritze vorzubereiten, nehmen Sie die Nadelnabe ab und setzen Sie die stumpfe 33-Gauge-Nadel auf. Nehmen Sie die Nabenabdeckung aus Metall und befestigen Sie die Nadel sicher an der Spritze. Spülen Sie die Nadel mit destilliertem Wasser, um die Dichtheit und Durchgängigkeit der Nadel zu testen.
Entleeren Sie dann die Spritze und legen Sie sie vorsichtig beiseite. Positionieren Sie dann die anästhesierte Maus auf einem Kissen und richten Sie das Behandlungsauge auf das Mikroskopobjektiv aus. Tragen Sie 0,5%iges Proparacainhydrochlorid auf und warten Sie 30 Sekunden.
Tragen Sie dann 150 Mikroliter Augengel auf das Auge auf und kleben Sie ein rundes Deckglas auf. Führen Sie eine vorläufige Augenuntersuchung durch, bei der Sie die Hornhaut, die Iris, die Pupille, die Linse und die Bindehaut beobachten. Passen Sie die Fokusebene an, um den Fundus des Mausauges durch die Pupille zu visualisieren.
Richten Sie dann den Kopf so aus, dass der Sehkopf mit der Mitte der Pupille ausgerichtet ist. Klopfen Sie anschließend auf die Basis des Röhrchens, das HESC-abgeleitete Photorezeptor-Vorläuferzellen enthält, um eine gleichmäßige Zellsuspension zu erhalten. Ziehen Sie mit einer 10-Mikroliter-Glasmikroliterspritze mit einer stumpfen 33-Gauge-Nadel zwei Mikroliter Zellmischung auf.
Verwenden Sie eine 30-Gauge-Einwegnadel, um eine Sklerektomiewunde zu erzeugen, die zwei Millimeter hinter dem Limbus positioniert ist. Halten Sie den Winkel der Nadel bei ca. 45 Grad, um einen Kontakt mit der Linse zu vermeiden. Sobald die Nadelspitze im Auge sichtbar wird, ziehen Sie die Nadel vorsichtig zurück.
Entsorgen Sie die gebrauchte Nadel in einem scharfen Behälter, um Verletzungen durch Nadelstiche zu vermeiden. Nehmen Sie nun die Glasspritze und führen Sie die stumpfe Nadel in die Sklerektomiewunde ein. Schieben Sie die stumpfe Nadel vor, ohne die Linse zu berühren, bis sie die gegenüberliegende Netzhaut der Eintrittswunde erreicht.
Sanft in die Netzhaut eindringen, bis ein Druckzweig auf der Sklera zu sehen ist. Injizieren Sie dann zwei Mikroliter der Zellsuspension oder des PRDM-Mediums in den subretinalen Raum unter Beibehaltung eines sanften Drucks auf die Spritze. Die Bildung einer sichtbaren Blase deutet auf eine erfolgreiche Injektion hin.
Warten Sie 10 Sekunden, damit sich die Zellen beruhigen können. Ziehen Sie die Nadel vorsichtig aus dem Auge zurück. Um die Blase zu visualisieren, bewegen Sie den Mauskopf, um das Auge unter dem Mikroskop zu positionieren, und sichern Sie die Position, indem Sie den Kopf vorsichtig halten.
Verwenden Sie für die intraoperative OCT die IOCT-Funktion am Operationsmikroskop und wählen Sie den Würfel auf dem OCT-Bildschirm aus. Positionieren Sie den Scanbereich auf der Blase, indem Sie die Pfeiltasten drücken. Um das OAT, die Zentrierung und den Fokus für die beste OCT-Qualität anzupassen, drücken Sie auf Erfassen oder Scannen, um den OCT-Scan des Blöd-Bereichs zu erfassen, und überprüfen Sie die Bilder, um die Qualität der Scans zu überprüfen.
Zum Schluss entfernen Sie das Deckglas und reinigen das Gel vorsichtig mit Gaze. Verabreichen Sie einmal nach der Injektion eine antibiotische Salbe, um eine Infektion zu verhindern. Der OCT-Scan zeigte deutliche HESC-Entitäten, die im zellbehandelten Auge suspendiert waren.
Im Gegensatz dazu zeigte das medial behandelte Auge eine ungetrübte Flüssigkeit, keine Zellen innerhalb des subretinalen Raums.
