Zu Beginn injizieren Sie der Maus AAV-assoziierte Vektoren in das Mäusegehirn. Rasieren Sie nach drei bis vier Wochen Virusinjektion den Bauch- und Rückenbereich des Halses einer betäubten Maus. Reinigen Sie die rasierten Bereiche mit drei Jodpeelings im Wechsel mit 70%iger Ethanollösung.
Machen Sie einen ventralen Schnitt in der Haut zwischen den Schulterblättern. Legen Sie anschließend chirurgische Gaze über den Schnitt und positionieren Sie das Tier in Rückenlage, wobei der Kopf zum Chirurgen zeigt. Machen Sie dann einen kleinen vertikalen Schnitt auf der rechten Seite des Halses oberhalb des Schlüsselbeins, um die rechte Halsschlagader und die Halsvene freizulegen.
Nach der Trennung des Unterhautgewebes legen Sie die rechte äußere Halsvene frei und legen die Naht unter die Vene. Binden Sie das distale Ende der Halsvene ab, um den Blutfluss zu stoppen. Machen Sie mit einer Mikrozange und einer Schere einen kleinen Schnitt in die kollabierte Vene.
Führen Sie nun den Venenkatheter mit der Fase nach unten ein und bewegen Sie ihn proximal in Richtung der oberen Hohlvene, bis er den rechten Vorhof erreicht. Befestigen Sie den Katheter mit einer 7-0-Seidennaht am Gefäß. Präparieren Sie das Bindegewebe, um die rechte Arteria carotis communis freizulegen.
Platzieren Sie proximal zwei 7-0-Seidennahtschlaufen, die auf der Höhe, in der sich die inneren und äußeren Halsschlagadern teilen, unbefestigt bleiben. Um den Blutfluss vorübergehend zu stoppen, ziehen Sie an einer vorplatzierten Nahtschlaufe. Erstellen Sie dann mit einer Mikroschere oder einer 27-Gauge-Nadel eine kleine Öffnung an der Gefäßwand.
Führen Sie den arteriellen Katheter proximal ein, während Sie die Nahtschlaufe lösen, und schieben Sie den Katheter vor, um den Aortenbogen zu erreichen, ohne die Aortenklappe zu berühren. Verwenden Sie die beiden vorplatzierten Nähte, um den Katheter am Gefäß zu befestigen. Tunneln Sie alle Katheter subkutan, verlagern Sie sie im Nacken über den vorgeschnittenen Schnitt und schließen Sie den ventralen Schnitt.
Verbinden Sie die Katheter mit den venösen oder arteriellen Anschlüssen des silikonbeschichteten Schlauchanschlusses aus 25-Gauge-Nadelschlauch. Nach dem Schließen des ventralen Schnitts den Konnektor subkutan sichern, wenn die Rückenhaut mit Nähten versiegelt ist. Füllen Sie die Katheter mit heparinisierter Kochsalzlösung und verschließen Sie die Enden der Katheter fest.
Um das Tier 24 Stunden nach der Operation an einem automatischen Blutentnahmesystem zu befestigen, verbinden Sie den Haltehaken mit dem Metallring am Nacken und verbinden Sie die arterielle Leitung. Sobald der arterielle Katheter an die Injektionsleitung angeschlossen ist, befestigen Sie die Venenkatheter an den Probenahmeleitungen. Stellen Sie die Injektionszeit und -dosis auf 0,5 Milligramm pro Kilogramm bei 500 Mikrolitern pro Minute ein.
Stellen Sie die Zeit und Häufigkeit der Blutentnahme ein, einschließlich der Probenverdünnung mit Kochsalzlösung. Das System füllt automatisch die gleiche Menge Kochsalzlösung auf, um das entnommene Blut zu ersetzen. Führen Sie eine automatisierte Vorinjektion durch.
Führen Sie als Nächstes eine automatisierte intravenöse Injektion des Medikaments Clozapin N-oxid mit einer Injektionsrate von 500 Mikrolitern pro Minute durch. Führen Sie dann eine Blutentnahme nach der Injektion durch. Es werden luteinisierende Hormonmuster bei erwachsenen Kiss1-EYFP-Weibchen vorgestellt, die eine einseitige stereotaktische Injektion von AAV-hM3Dq-mCherry in den Nucleus arcuatus erhielten.
Der Spiegel des luteinisierenden Hormons Diestrus ist im Allgemeinen niedrig, aber Schwankungen werden normalerweise aufgrund seiner pulsierenden Freisetzung beobachtet. Ein starker Anstieg des luteinisierenden Hormonspiegels tritt als Reaktion auf die Injektion von Clozapin N-Oxid auf. Die meisten mCherry-Neuronen, die mit Kiss1-EYFP kolokalisiert wurden, zeigten, dass die virale und neuronale Aktivierung spezifisch für die Zielpopulation ist.
Es wird ein pulsierendes Freisetzungsmuster des luteinisierenden Hormons in Wildtyp-Mäusen gezeigt, gefolgt von der Reaktion auf eine IP-Injektion von Kisspeptin-10. Es wurden klare luteinisierende Hormonimpulse beobachtet, die typisch für eine Frau in Diöstrus sind und niedrige basale luteinisierende Hormonspiegel zeigten. Ein sofortiger und robuster Anstieg des luteinisierenden Hormons wurde als Reaktion auf die Verabreichung von Kisspeptin festgestellt.
