Mouse Splenic Single-Cell Suspension Generation and FACS Staining for Flow Cytometry-Based Sorting

Legen Sie zunächst ein 70-Mikron-Zellsieb auf ein 50-Milliliter-Zentrifugenröhrchen und befeuchten Sie es mit PBS. Nachdem Sie die Milz von einer Maus isoliert haben, um eine Einzelzellsuspension zu erzeugen, führen Sie die Milz mit der Daumenstütze eines Spritzenkolbens und 30 Millilitern kaltem PBS durch das Netz. Das Filtrat wird fünf Minuten lang bei 300 g zentrifugiert und der Überstand entfernt.

Das Pellet wird in einem Milliliter Ammoniumchlorid-Kalium-Kalium-Lysepuffer resuspendiert und zwei Minuten lang bei Raumtemperatur inkubiert. Nach der Lyse werden 50 Milliliter kaltes PBS in das Röhrchen gegeben, dann zentrifugiert und der Überstand verworfen, bevor das Pellet in den frisch zubereiteten Antikörpercocktail resuspendiert wird. Die Zellsuspension in ein fünf Milliliter fassendes FACS-Röhrchen überführen und 30 Minuten bei vier Grad Celsius im Dunkeln inkubieren.

Nach der Inkubation drei Milliliter kaltes PBS in das Röhrchen geben, dann zentrifugieren und den Überstand verwerfen, bevor das Pellet in einem Milliliter kaltem FACS-Resuspensionspuffer resuspendiert wird. Filtern Sie die Zellen durch eine Filterkappe FACS-Röhrchen.