Geben Sie zunächst 30 Gramm Natriumchlorid in sechs Liter deionisiertes Wasser in einen Mantelflüssigkeitstank und schütteln Sie den Tank, um das Salz aufzulösen. Schließen Sie dann den Tank an einen Zellsortierer an. Schalten Sie den Zellsortierer ein, starten Sie das Fluidiksystem und warten Sie, bis sich die Fluidik ausgeglichen hat.
Richten Sie die Drop-Verzögerung ein. Zur Herstellung einer Hefeextrakt-Stammlösung wird ein Aliquot Kohlenstoff-13-Hefeextrakt in 7,5 Milliliter Reinstwasser und 2,5 Milliliter Methanol resuspendiert. Um dann den Extraktionspuffer herzustellen, geben Sie 10 Mikroliter Kohlenstoff-13-Hefeextrakt-Stammlösung zu 10 Millilitern Acetonitril und mischen Sie es gut.
Geben Sie 25 Mikroliter des Extraktionspuffers in jede Vertiefung einer 96-Well-PCR-Platte und decken Sie die Vertiefungen mit einem Deckel ab. Legen Sie die Platte auf den Zellsortierer, um die sortierten Zellen zu sammeln. Sortieren Sie jeweils 5000 Ereignisse von Alexa Fluor 647-positiven und PE-negativen Populationen in die ersten vier Vertiefungen.
Sortieren Sie dann jeweils 5000 Ereignisse der PE-positiven und Alexa Fluor 647-negativen Populationen in die nächsten vier Wells. Sortieren Sie als Nächstes für hämatopoetische Stammzellen 5000 Ereignisse der PE-Cy7 niedrigen, PE-positiven, APC-Cy7-positiven, Brilliant Violet 605 positiven und Brilliant Violet 421 negativen Population in die erste Vertiefung, gefolgt von der Sortierung von 5000 Ereignissen der PE-Cy7 niedrigen, PE-positiven, APC-Cy7-positiven, Brilliant Violet 421 positiven und Brilliant Violet 605 negativen Population in die nächste Vertiefung. Wählen Sie für Trümmerproben Ereignisse aus, die zu klein sind, um intakte Zellen auf der Grundlage von Vorwärts- und Seitwärtsstreusignalen darzustellen.
Schalten Sie als Nächstes das LC-MS-Instrument ein. Legen Sie die Probenplatte in den Autosampler des Geräts. Öffnen Sie die LC-MS-kompatible Software und bereiten Sie das Gerät für die Analyse vor.
Führen Sie mindestens vier Prozess-Leer- oder Poolproben durch, um die Säule auszugleichen, und eine LC-Testmischung, um die chromatographische Leistung zu überprüfen. Vergewissern Sie sich, dass der anfängliche und der maximale Gegendruck weniger als 150 bzw. 400 bar betragen. Stellen Sie dann sicher, dass die Aufbewahrungszeiten innerhalb eines Zeitfensters von einer Minute liegen.
Als nächstes wird überprüft, ob das Tal zwischen Leucin und Isoleucin im positiven Übergang von 132 zu 86 weniger als 20 % der Peakhöhe beträgt. Stellen Sie abschließend sicher, dass die Differenz zwischen AMP und ADP 1,5 bis 1,9 Minuten und zwischen ADP und ATP 1,1 bis 1,5 Minuten beträgt. Nachdem Sie die experimentellen Parameter bestätigt haben, richten Sie einen Lauf mit einer Prozessleer- oder Poolprobe ein, um die Verschleppung aus der LC-Testmischung zu minimieren, gefolgt von den Testproben in zufälliger Reihenfolge.
Die FACS-Sortierung ermöglicht die Isolierung von reinen Populationen verschiedener Zelltypen aus derselben Zellsuspension. Metabolische Unterschiede zwischen Zelltypen aus demselben Gewebe wurden mit Hilfe des FACS-Zell-CMS-Protokolls für hämatopoetische Stammzellen und multipotente Vorläuferzellen erhalten. Zellen von sechs Mäusen mussten sechs Proben erzeugen, was zu einer größeren Variabilität innerhalb jeder Gruppe im Vergleich zu B- und T-Zellen führte, die aus derselben murinen Milz sortiert wurden.
Trümmerproben, die Prozess-Leerproben darstellten, wurden klar von Proben getrennt, die Zellextrakte enthielten. Eine Heatmap mit Informationen über die relativen Konzentrationen von Metaboliten in verschiedenen Zelltypen ist hier dargestellt.
