Füllen Sie zunächst ein Glas Dounce mit zwei Millilitern eiskaltem Kernlysepuffer, der 0,01 % Digitonin enthält, und geben Sie die präparierten Hirngewebestücke der Maus hinein. Homogenisieren Sie das Gewebe mit einem Dounce-Gewebehomogenisator aus Glas jeweils 25 Mal mit den Stößeln A und B und überführen Sie das resultierende Homogenat in ein 15-Milliliter-Röhrchen. Zwei Milliliter eiskalter Kernlysepuffer mit 0,01 % Digitonin in das Homogenat geben und fünf Minuten lang auf Eis inkubieren.
Dann zentrifugieren Sie die Kerne bei 500 G fünf Minuten lang bei vier Grad Celsius. Entfernen Sie mit einer Mikropipette den Überstand und fügen Sie vier Milliliter eiskalten Kernlysepuffer mit 0,01 % Digitonin hinzu. Filtrieren Sie die Kernsuspension durch ein 40-Mikrometer-Zellsieb.
Zentrifugieren Sie die Kerne erneut, entfernen Sie den Überstand und fügen Sie vier Milliliter Färbepuffer hinzu, um die Kerne zu waschen. Nachdem die Suspension durch ein 40-Mikrometer-Zellsieb filtriert wurde, werden die Kerne durch Zentrifugation pelletiert und die Kerne in einem Milliliter PBS mit 0,04 % BSA- und RNase-Inhibitoren resuspendiert. Um die Zellen zu zählen, mischen Sie 10 Mikroliter 0,4%iges Trypanblau mit 10 Mikrolitern der Zellkerne in einem 0,5-Milliliter-Röhrchen.
Zählen Sie die Zellkerne mit einem automatischen Zellzähler. Überführen Sie 100 Mikroliter der Kerne in ein FACS-Röhrchen für die ungefärbte Kontrolle. Den verbleibenden Kernen werden 10 Mikroliter 7-AAD zugegeben, fünf Minuten lang bei vier Grad Celsius inkubiert und mit der Kernsortierung mittels FACS fortgefahren.
Anschließend werden 10 Mikroliter der sortierten Kerne in ein neues FACS-Röhrchen überführt, das 90 Mikroliter DPBS mit 2 % wärmeinaktiviertem FBS enthält. Nach dem Zentrifugieren der sortierten Kerne wird der Überstand mit einer Mikropipette entfernt und die Kerne in 100 Mikroliter verdünntem Kernpuffer resuspendiert. Vor der Sortierung enthält die Probe erhebliche Ablagerungen mit über 99 % Singuletts, die positiv auf eine Kernfärbung hindeuten, was auf eine effektive Zelllyse hinweist.
Die Gehirnkerne zeigten nach der Sortierung eine Erhöhung der Reinheit von anfänglich 36 % auf fast 100 %
