Nehmen Sie zunächst eine Durchstechflasche mit den hämatopoetischen Stamm- und Vorläuferzellen des Knochenmarks der Maus. Mit einer Mikropipette wird das Pellet in einem Milliliter ACK-Lysepuffer resuspendiert und ein bis zwei Minuten bei Raumtemperatur inkubiert. Die resuspendierte Mischung wird durch das vorfeuchte 70-Mikrometer-Zellsieb in ein 50-Milliliter-Röhrchen überführt.
Fügen Sie dann 10 Milliliter FACS-Puffer hinzu, um den ACK-Lysepuffer zu verdünnen. Zentrifugieren Sie das Gemisch bei 400 G für fünf Minuten bei vier Grad Celsius und resuspendieren Sie das Pellet in 10 Milliliter FACS-Puffer, indem Sie es zuerst in einem Milliliter Puffer resuspendieren und dann mit neun Millilitern Puffer auffüllen. Mischen Sie nun 10 Mikroliter 0,4%iges Trypanblau mit 10 Mikrolitern der Zellen in einem 0,5-Milliliter-Röhrchen und zählen Sie die Zellen mit einem automatischen Zellzähler.
Um die Zellen zu färben, zentrifugieren Sie die Zellen fünf Minuten lang bei 400 G bei vier Grad Celsius. Resuspendieren Sie das Pellet im FACS-Puffer, um eine Endkonzentration von eins mal 10 zu den sieben Zellen pro Milliliter zu erreichen, indem Sie das Pellet zuerst in einem Milliliter Puffer resuspendieren und dann mit dem verbleibenden Volumen auffüllen. Mit einer P1000-Mikropipette wird die Suspension durch eine 35-Mikrometer-Zellsiebkappe in ein FACS-Röhrchen überführt.
Bereiten Sie als Nächstes die Färbemischung vor, wie hier gezeigt. Nach der Zentrifugation wird die Zellsuspension in 300 Mikroliter Färbemischung in einem Probenröhrchen resuspendiert und 15 Minuten lang lichtgeschützt auf Eis inkubiert. Dann 300 Mikroliter Mix zwei in das Probenröhrchen geben und 20 Minuten auf lichtgeschütztem Eis inkubieren.
Geben Sie drei Milliliter des FACS-Puffers in die einfach gefärbten und gemischt gefärbten Probenröhrchen. Zentrifugieren Sie nun die Zellsuspension. Nachdem Sie den Überstand verworfen haben, resuspendieren Sie das Pellet in 500 Mikrolitern des FACS-Puffers.
Bereiten Sie ein 1,5-Milliliter-Röhrchen vor, das mit 500 Mikrolitern Sammelmedium vorgefüllt ist. Sobald das FACS-Gerät kalibriert ist, fügen Sie der Zellsuspension 500 Mikroliter FACS-Puffer hinzu und überführen Sie dann einen Milliliter der Probe durch eine 35-Mikrometer-Zellsiebkappe in ein neues FACS-Röhrchen. Nach der Zellsortierung werden 10 Mikroliter der sortierten Zellen in ein neues FACS-Röhrchen mit 90 Mikrolitern FACS-Puffer überführt.
Die Zellsuspension wird durch Zentrifugation pelletiert und in 50 Mikrolitern PBS mit 0,04 % BSA resuspendiert. Füllen Sie die Suspension in ein 0,2-Milliliter-Röhrchen und geben Sie 50 Mikroliter PBS mit BSA in das Originalröhrchen, um alle übrig gebliebenen Zellen aufzufangen. Übertragen Sie die Zellen in das 0,2-Milliliter-Röhrchen, um ein Gesamtvolumen von 100 Mikrolitern zu erreichen.
Führen Sie ein Pilotexperiment durch, um die beste Lysezeit für die Zellkernisolierung zu ermitteln. Nach dem Pelletieren der Kerne wird das Kernpellet in 12 Mikroliter verdünntem Kernpuffer resuspendiert. Geben Sie zwei Mikroliter Zellkerne in ein Röhrchen, das 0,4 % Trypanblau und acht Mikroliter PBS mit 0,04 % BSA enthält, und zählen Sie die Zellkerne mit einem automatischen Zellzähler.
Nach Abschluss der Kernisolierung werden sechs Mikroliter Kernresuspension in ein neues FACS-Röhrchen überführt, das mit 150 Mikrolitern FACS-Puffer vorgefüllt ist. Fügen Sie drei Mikroliter 7-AAD hinzu und inkubieren Sie fünf Minuten lang auf Eis.
