Spülen Sie zunächst die obere Kammer der 24-Well-Platten mit PBS. Mischen Sie die BEND3-Zellen mit DMEM-Medium unter Verwendung eines Vortex-Mischers, um eine Suspension herzustellen. Dann werden 200 Mikroliter BEND3-Zellsuspension auf die PET-Membran in der oberen Kammer einer 24-Well-Platte gestreut.
Geben Sie 1.200 Mikroliter des kompletten Mediums in die untere Kammer der Platte, um den osmotischen Druck der oberen und unteren Kammer zu stabilisieren. Wechseln Sie das Medium, indem Sie das alte Medium langsam mit einer Unterdruckpipette von einer Seite entfernen und während des Flüssigkeitsaustauschs ein neues Medium entlang der Wand hinzufügen. Stellen Sie vor der TEER-Messung den Widerstand, 5%ige Natriumhypochloritlösung, 75%iges Ethanol und doppelt destilliertes Wasser auf einen ultrareinen Tisch.
Schalten Sie die UV-Bestrahlung für 30 Minuten ein, um Restbakterien und Krankheitserreger zu entfernen. Legen Sie die Elektroden in eine 5%ige Natriumhypochloritlösung und schütteln Sie sie drei bis fünf Sekunden lang. Dann 15 Minuten lang in 75%iges Ethanol eintauchen.
Zum Schluss bis zur Verwendung in PBS oder doppelt destilliertes Wasser umfüllen. Schalten Sie als Nächstes den Schalter auf der Rückseite der Zellwiderstandsanzeige ein. Klicken Sie auf Platte auswählen und wählen Sie 24-Well-Platte aus.
Wählen Sie je nach Vorgang die entsprechende Erkennungssequenz aus. Stecken Sie einen Kiloohm-Widerstand in den rechten Stecker, um das Gerät zu kalibrieren. Wenn das Kalibrierungsergebnis 1000 plus minus 5 Ohm beträgt, betrachten Sie das Gerät als genau.
Ist dies nicht der Fall, klicken Sie auf der Hauptschnittstelle auf Moduseinheiten, um Ohm auszuwählen, und klicken Sie dann auf Kalibrieren. Entfernen Sie dann den Kiloohm-Widerstand und ersetzen Sie ihn mit einem Verbindungsdraht durch die Messelektrode. Legen Sie die Elektrode senkrecht in die 24-Well-Platte, die nur Medium enthält, und klicken Sie auf Blank Handling (Rohlingshandhabung) auf dem Gerät.
Der Hintergrundwert des Plattenwiderstandes ohne sitzende Zellen sollte etwa 134,4 Ohm betragen. Als nächstes führen Sie die beiden Elektroden in die obere und untere Kammer der Sitzplatte ein, so dass sich die Zellschicht dazwischen befindet. Notieren Sie den Widerstandswert, indem Sie vorsichtig auf das Pedal treten.
Achten Sie darauf, dass die Elektrode die Zellen in der oberen Kammer und den Boden der unteren Kammer nicht berührt. Ermitteln Sie TEER-Werte, indem Sie die elektrischen Widerstandswerte mit dem unteren Bereich der oberen Kammer multiplizieren, wie in der Gleichung gezeigt. Zeichnen Sie ein Liniendiagramm von TEER in Abhängigkeit von der Zeit in Tagen.
Wenn der Widerstandswert mit der Zeit nicht ansteigt, haben die Zellen eine Barriere gebildet. Die über die Zeit aufgetragenen Widerstandswerte für BEND3-Zellen zeigten, dass sich die Zell-TEER-Werte am fünften Tag zu stabilisieren begannen.
