Nach der Kultivierung der aufgetauten kryokonservierten Blutprobe wird diese mit den erforderlichen Röntgendosen bei Raumtemperatur bestrahlt. Geben Sie dann 1,62 Milliliter warmes RPMI-Nährmedium in jede Vertiefung. Um die Zellteilung in T-Lymphozyten anzuregen, fügen Sie 40 Mikroliter Phytohämagglutinin in jede Vertiefung hinzu und resuspendieren Sie gründlich.
Inkubieren Sie die Platte 23 Stunden lang bei 37 Grad Celsius und 5 % Kohlendioxid. Am nächsten Tag fügen Sie acht Mikroliter Cytochalasin B pro Vertiefung hinzu, um die Zytokinese zu blockieren. Nach 70 Stunden nehmen Sie die Platte aus dem Inkubator und überführen Sie die Zellsuspension in ein 15-Milliliter-Röhrchen.
Spülen Sie jede Vertiefung mit zwei Millilitern PBS aus und geben Sie dieses PBS in das 15-Milliliter-Röhrchen. Zentrifugieren Sie die Zellsuspension acht Minuten lang bei 180 g und verwerfen Sie den Überstand, wobei 500 Mikroliter über dem Pellet verbleiben. Während Sie das Pellet vortexen, geben Sie zwei Milliliter kaltes Kaliumchlorid in das Röhrchen.
Zentrifugieren und verwerfen Sie den Überstand, wie zuvor gezeigt. Das Pellet wird durch langsame Zugabe von zwei Millilitern kaltem Fixiermittel 1 vorgewirbelt und über Nacht bei vier Grad Celsius inkubiert. Am nächsten Tag zentrifugieren und den Überstand entsorgen.
Während Sie das Pellet tropfenweise vortexen, geben Sie zwei Milliliter kaltes Fixiermittel 2 in das Röhrchen. Lassen Sie die Tube über Nacht bei vier Grad Celsius stehen. Zentrifugieren Sie die Probe und geben Sie den Überstand in ein anderes Röhrchen, um die Zellen entsprechend der Pelletgröße zu konzentrieren.
Reinigen Sie die Objektträger mit Isopropanol und beschriften Sie sie ordnungsgemäß. Nach dem Vortexen des Pellets 40 Mikroliter feste Zellsuspension auf einen Objektträger geben. Tauchen Sie den Objektträger nach dem Trocknen eine Minute lang in die Beize Acridinorange.
Waschen Sie den Objektträger dann schnell mit destilliertem Wasser, bevor Sie ihn für eine Minute in einen Phosphatpuffer legen. Trocknen Sie die Rückseite des Objektträgers ab und legen Sie ihn auf sauberes Seidenpapier. Geben Sie 20 Mikroliter Phosphatpuffer auf den Objektträger und decken Sie ihn mit einem sauberen Deckglas ab, um Luftblasen zu vermeiden.
Versiegeln Sie den Objektträger mit Silikonzement. Legen Sie den Objektträger unter ein Fluoreszenzmikroskop und untersuchen Sie zweikernige Zellen. Zum Schluss zählen Sie die Mikrokerne manuell.
Das Vorhandensein von abgerundeten zweikernigen Zellen deutete auf eine erfolgreiche Entnahme gesunder lebensfähiger Zellen aus kryokonservierten Vollblutproben hin. Bei erhöhter Strahlendosis wurde ein linearer quadratischer Anstieg der Mikronukleusausbeute beobachtet. Die Hintergrund-Mikronukleus-Ausbeute in scheinbestrahlten Kontrollproben resultierte hauptsächlich aus verzögerten Chromosomen.
