Stellen Sie zunächst sicher, dass die Scannerplatten mit geladenen Nematoden bereit sind. Im Allgemeinen sind etwa 40 Tiere und 200 Mikroliter Bakterienrasen pro Platte optimale Bedingungen für ein lebenslanges Experiment. Beginnen Sie den Versuchsaufbau, indem Sie auf beiden Seiten der Glasscheiben einen Anti-Beschlag-Glasreiniger auftragen, der die Scannerplatten stützt.
Tragen Sie dann eine hydrophobe Schutzglasbehandlung auf die Seite des Glases auf, die mit den Scannerplatten in Kontakt kommt. Warten Sie fünf bis 10 Minuten und entfernen Sie alle Rückstände auf der Glasscheibe. Tragen Sie 70%iges Ethanol auf, um die Seite des Glases zu desinfizieren, die mit den Scannerplatten in Berührung kommt.
Ein bis zwei Minuten einwirken lassen und dann das Ethanol mit einem Tuch oder Papiertuch entfernen. Um die Platten auf die Scanner zu laden, legen Sie die Autoklaven-Gummimatten auf das behandelte Plattenträgerglas. Nehmen Sie die Scannerplatten, die für die Bildgebung mit geladenen Nematoden verwendet werden, und entfernen Sie den Deckel.
Legen Sie die Platten auf Gummimatten, die der Glasoberfläche zugewandt sind. Ziehen Sie den Netzstecker der Scannerlüfter, um die Finger des Versuchsleiters während des Einlegens der Platte zu schützen. Schieben Sie die Platten und die sie stützenden Glasscheiben vorsichtig auf die Oberfläche des Scanners.
Aktivieren Sie die Scannerlüfter wieder und vergewissern Sie sich, dass die vorderen und seitlichen Lüfter mit Strom versorgt werden. Schalten Sie an dieser Stelle die Scanner ein. Bevor Sie mit dem Experiment beginnen, führen Sie die wesentlichen Schritte vor der Bildaufnahme durch, einschließlich der Erstellung eines Vorschaubildes der gesamten Scanneroberfläche.
Suchen Sie über die Weboberfläche den Abschnitt "Bilderfassung" auf der Hauptseite und folgen Sie dem Link "Aufnahmegeräte und Bildserver". Klicken Sie im geöffneten Feld auf Nach neuen Geräten suchen und stellen Sie sicher, dass jeder an den Server angeschlossene Scanner im Feld Bilderfassungsgeräte angezeigt wird. Aktivieren Sie das Kontrollkästchen für jeden Scanner, der neu geladene Platten enthält, und klicken Sie dann auf die Schaltfläche Vorschauaufnahme anfordern.
Wählen Sie als Nächstes im Worm-Browser die Option Datei "Bild öffnen" und wählen Sie dann das gewünschte Bild aus, um die einzelnen Vorschaubilder zu öffnen. Klicken Sie für jedes Bild auf die Spalten, die den Bereichen entsprechen, die Platten enthalten. Sobald alle Bilder definiert sind, wählen Sie Bilderfassung aus.
Definieren Sie Scanbereiche, speichern Sie ausgewählte Scanbereiche auf einem Datenträger, und wählen Sie dann den gewünschten Speicherort aus, um die Spezifikationen des Bereichs auf den Datenträger zu exportieren. Stellen Sie eine Datei zusammen, die den Namen des Experiments, die physischen Positionen der einzelnen Spalten auf den Scannern, die Gesamtdauer des Experiments und die Häufigkeit der Bildaufnahme enthält. Speichern Sie diese als Text- und XML-Datei.
Klicken Sie im Worm-Browser auf Bilderfassung, senden Sie den Versuchsplan und wählen Sie die generierte XML-Datei aus. Der Worm-Browser fragt Sie, ob eine Zusammenfassung des Zeitplans ausgegeben oder das Experiment ausgeführt werden soll. Generieren Sie eine Zusammenfassungsdatei, überprüfen Sie die Daten der geplanten Erfassungen, den Speicherort, den Namen und die Anzahl der Scanner in der Zusammenfassung.
Laden Sie erneut die XML-Datei für den Experimentzeitplan, wie gezeigt. Der Worm-Browser fragt ein zweites Mal, ob eine Zusammenfassung des Zeitplans ausgegeben oder das Experiment ausgeführt werden soll. Wählen Sie dieses Mal aus, dass Sie das Experiment ausführen möchten.
Die Lifespan-Maschine arbeitet nun autonom, bis die letzten Scans, die im Versuchsplan angegeben sind, abgeschlossen sind. Nachdem das Experiment beendet ist und alle Schritte zur Bild- und Portoerfassung durchgeführt wurden, überprüfen Sie die automatisierten Ergebnisse manuell mithilfe des Worm-Browsers. Klicken Sie im Menü des Worm-Browsers auf Datei, wählen Sie das aktuelle Experiment aus und wählen Sie das gewünschte Experiment aus.
Um das Storyboard zu generieren, klicken Sie auf Validierung, durchsuchen Sie das gesamte Experiment und wählen Sie dann unmittelbar nach dem Tod jedes Wurms aus. Klicken Sie mit der rechten Maustaste auf das Bild des Objekts, um Nicht-Wurm-Objekte aus dem Storyboard auszuschließen. Um alle Objekte auf einer Seite gleichzeitig auszuschließen, halten Sie die Strg-Taste gedrückt und klicken Sie mit der rechten Maustaste auf ein beliebiges Objekt.
Klicken Sie zweimal mit der rechten Maustaste, um ein ausgeschlossenes Objekt erneut in die Analyse einzubeziehen. Um die während der Storyboard-Anmerkung erstellten Anmerkungen zu speichern, klicken Sie auf die Schaltfläche Speichern. Klicken Sie einmal mit der linken Maustaste auf ein beliebiges Objekt des Storyboards, um ein neues Fenster zu öffnen, in dem detaillierte Zeitreiheninformationen zu diesem Objekt angezeigt werden.
Um die Todeszeiten manuell zu kommentieren, klicken Sie mit der linken Maustaste auf die untere Leiste an der Stelle, die dem Zeitpunkt des Todes entspricht. Verwenden Sie die Leertaste und die Pfeile nach rechts oder links auf der Tastatur, um sich durch die Zeitrahmen zu bewegen, oder klicken Sie direkt auf die Leiste im gewünschten Zeitrahmen. Kommentieren Sie die Kontraktions- und Expansionsereignisse manuell, indem Sie mit der rechten Maustaste auf die untere Leiste im gewünschten Zeitrahmen klicken.
Sehen Sie sich die Überlebenskurven auf der linken Seite und das Streudiagramm an, in dem der Zeitpunkt der Beendigung der Bewegung mit dem Todeszeitpunkt für jedes Individuum auf der rechten Seite des Storyboards verglichen wird. Um die Todeszeiten für ein Experiment zu generieren, wählen Sie im Worm-Browser Datendateien und Sterbezeiten aus und klicken Sie dann auf Sterbezeiten für aktuelles Experiment generieren. Der Effekt der manuellen Datenvalidierung auf die Überlebenskurven wird hier gezeigt.
Die anfänglichen Überlebenskurven, die vor der Storyboard-Anmerkung erstellt wurden, wurden durch die unsachgemäße Einbeziehung der Nicht-Wurm-Objekte verzerrt. Nach dem Ausschluss von Nicht-Wurm-Objekten während der manuellen Storyboard-Anmerkung zeigten die resultierenden Überlebenskurven eine deutlich verbesserte Auflösung. Die grafische Darstellung zeigt die geschätzte durchschnittliche verbleibende Lebensdauer in verschiedenen Schritten der Analyse nach der Bildaufnahme und ihre Korrelation mit der Lebensdauer des Wurms.
Es wurde festgestellt, dass die manuelle Annotation der Sterbezeiten in der Verhaltensalterungsanalyse besonders wichtig bei länger lebenden Würmern ist. In diesem Fall diejenigen, die den geringsten Konzentrationen von Ochsen ausgesetzt sind. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass die automatisierte Schätzung der Todeszeit der Lebensspannenmaschine für Überlebenstests ausreichend genau ist.
Während Behavioral Aging Assays von manuellen Annotationen profitieren können.
