Führen Sie die Isolierung von Limbus-Nischenzellen (LNCs) durch, während Sie unter sterilen Bedingungen auf einer ultrareinen Werkbank arbeiten. Entnehmen Sie das Limbusgewebe aus dem intermediären Hornhautspeichermedium. Kratzen Sie mit einer sterilen chirurgischen Rundklinge die Iris und das Endothel um die Hornhaut herum ab und entfernen Sie sie.
Als nächstes schneiden Sie mit der sterilen chirurgischen Rundklinge das Limbusgewebe in 12 gleich große Stücke, wobei auf beiden Seiten der Hornhaut und der Sklera nur ein Millimeter Gewebe übrig bleibt. Danach werden die 12 Limbus-Gewebestücke auf eine 35-Millimeter-Kulturplatte übertragen und 1 Milliliter Kollagenase A hinzugefügt, um das Gewebe vollständig in die Platte einzutauchen. Verdauen Sie das Gewebe, indem Sie die Kulturplatte 18 Stunden lang in einem 37 Grad Celsius heißen Zellinkubator inkubieren.
Tauen Sie die Matrigel oder Kellermembranmatrix in einem auf 4 Grad Celsius eingestellten Kühlschrank auf. Bereiten Sie einen sterilisierten Beutel mit 200 Mikroliter- und 1-Milliliter-Spitzen, ein 15-Milliliter-Zentrifugenröhrchen und eine 6-Well-Platte vor und stellen Sie den Beutel 20 Minuten lang bei minus 20 oder minus 80 Grad Celsius ein. Nachdem Sie die Spitzen, das Zentrifugenröhrchen und die 6-Well-Platte aus dem Kühler entnommen haben, führen Sie die nächsten Schritte auf einer ultrareinen Werkbank durch.
Mit einer vorgekühlten 200-Mikroliter-Spitze 50 Mikroliter der aufgetauten Basalmembranmatrix in 1 Milliliter MESCM pipettieren und vorsichtig mischen. Mit einer vorgekühlten 1-Milliliter-Spitze, die auf einer Pipette angebracht ist, wird die resultierende 5%-Basalmembranmatrix in eine einzelne Vertiefung der vorgekühlten 6-Well-Kulturplatte überführt. Schütteln Sie die 6-Well-Platte vorsichtig horizontal, bevor Sie sie etwa eine Stunde lang bei 37 Grad Celsius in einen Inkubator legen, um die mit 5 % Matrigel beschichtete Kulturplatte vorzubereiten.
Nach der 18-stündigen Verdauung wird das Kollagenase A verdautes Limbusgewebe entnommen, das meist kleine sichtbare Cluster enthält. Verwenden Sie unter einem Stereomikroskop eine 200-Mikroliter-Pipettenspitze, um die Cluster vom unverdauten Skleralgewebe zu lösen. Tauchen Sie die abgelösten Cluster in 0,25%Trypsin-EDTA in eine 35-Millimeter-Kulturplatte und inkubieren Sie die Platte 15 Minuten lang.
Geben Sie dann 1 Milliliter MESCM mit 10%igem Knockout-Serum auf die Platte, um die Zellverdauung zu unterdrücken. Pipettieren Sie die Suspension vorsichtig mit einer 1-Milliliter-Pipettenspitze auf und ab, um die Cluster in einzelne Zellen zu zerlegen. Die Zellsuspension wird in ein 15-Milliliter-Zentrifugenröhrchen überführt und bei 200 g fünf Minuten lang bei Raumtemperatur zentrifugiert.
Ohne das Zellpellet zu stören, entfernen Sie vorsichtig den Überstand und fügen Sie 1 Milliliter MESCM hinzu, um die Zellen zu resuspendieren. Pipettieren Sie den Inhalt mit einer 1-Milliliter-Pipettenspitze zwei- bis dreimal auf und ab, um sicherzustellen, dass das gesamte Pellet in MESCM resuspendiert wird. Sammeln Sie 20 Mikroliter aus der Suspension für die Zellzählung.
Als nächstes wird die Zellsuspension mit einer 1-Milliliter-Pipette auf die mit 5 % Basalmembranmatrix beschichtete 6-Well-Platte übertragen. Fügen Sie MESCM hinzu, um das Gesamtvolumen in der Vertiefung auf 2,5 Milliliter zu erhöhen. Schütteln Sie die 6-Well-Platte vorsichtig horizontal, um eine gleichmäßige Verteilung der Zellen zu gewährleisten.
Nach der Bildgebung der Zellen werden sie bei 37 Grad Celsius in einen Zellkultur-Inkubator überführt. Das demonstrierte Protokoll verdaute erfolgreich das Sklerarandgewebe der Hornhaut und erzeugte Cluster, die unter dem Mikroskop sichtbar gemacht werden konnten. Erwartungsgemäß ähnelten die Büschel der Form einer Raupe.
Die primären LNCs wuchsen langsam und benötigten etwa 12 Tage für die Kultivierung. LNCs von Passage 1 bis Passage 8 benötigten etwa drei Tage für die Passage, aber die Wachstumsrate der LNCs nach Passage 9 nahm signifikant ab. Morphologisch waren die LNCs spindelförmig und in Passage 0 rund.
Nach Durchgang 3 waren sie spindelförmig mit einheitlichen Größen. Die Anzahl der Zellverdopplungen oder NCD repräsentierte die Wachstumsrate der LNCs. Die NCD- und die akkumulativen NCD-Kurven zeigten, dass die LNCs von Passage 3 zu Passage 5 am schnellsten wuchsen.
