Um die Limbus-Nischenzellen oder LNCs durch Immunfluoreszenzfärbung zu identifizieren, fügen Sie 1 Milliliter 0,25%iges Trypsin-EDTA pro Well zu den LNCs hinzu, die in einer 5%-Matrigel beschichteten 6-Well-Platte kultiviert wurden. Verdauen Sie die Zellen, indem Sie die Platte fünf Minuten lang bei 37 Grad Celsius inkubieren. Stillen Sie die Verdauung, indem Sie der Zellsuspension 1 Milliliter MESCM-haltiges Knockout-Serum hinzufügen.
Füllen Sie die Zellsuspension in ein Zentrifugenröhrchen und zentrifugieren Sie sie fünf Minuten lang mit 200 g, bevor Sie den Überstand vorsichtig absaugen. Resuspendieren Sie das Pellet in einem Milliliter MESCM. Anschließend werden mit einer Zytofuge 80 Mikroliter der Zellsuspension gemäß den Anweisungen des Herstellers gleichmäßig auf vier Objektträger aufgetragen.
Fixieren Sie die Zellen ca. 10 Minuten lang mit 4%Paraformaldehyd. Permeabilisieren Sie dann die Zellen auf den Objektträgern mit 0,2 % Triton X-100 in PBS für 15 Minuten. Blockieren Sie die Zellen eine Stunde lang mit 2%igem Rinderserumalbumin, bevor Sie sie über Nacht bei 4 Grad Celsius mit primären Antikörpern auf einem Shaker inkubieren.
Entfernen Sie nach der Inkubation ungebundene Antikörper, indem Sie die Objektträger dreimal für jeweils fünf Minuten mit PBST waschen. Anschließend wird die Probe eine Stunde lang bei 37 Grad Celsius mit geeigneten Sekundärantikörpern inkubiert, bevor alle ungebundenen Antikörper gewaschen werden, wie zuvor gezeigt. Die Zellkerne werden mit DAPI mit einer Konzentration von 5 Mikrogramm pro Milliliter gegengefärbt.
Nachdem Sie die Objektträger versiegelt haben, führen Sie eine Bildgebung mit einem Fluoreszenzmikroskop durch. Extrahieren Sie mit einem RNA-Isolationskit die Gesamt-RNA aus den LNCs gemäß den Anweisungen des Herstellers. Anschließend werden mit einem komplementären DNA- oder CDNA-Transkriptionskit mit hoher Kapazität 1 bis 2 Mikrogramm der RNA rückwärts transkribiert.
Bereiten Sie eine 20-Mikroliter-Lösung vor, die 2,5 Mikroliter CDNA, 0,8 Mikroliter entsprechenden genetischen Primer, 10 Mikroliter eines universellen PCR-Mastermixes und 6,7 Mikroliter doppelt destilliertes Wasser enthält. Führen Sie dann eine quantitative Polymerase-Kettenreaktion unter den entsprechenden Bedingungen durch. Wenden Sie schließlich die vergleichende CT-Technik an, um die relative Genexpression zu untersuchen.
Die doppelte Immunfärbung der vierten Passage LNCs zeigte deutlich, dass diese Zellen durchweg panCK-negativ, VIM-positiv, CD90-positiv, CD105-positiv, SCF-positiv und PDGFR-positiv waren.
