Injektion von aus der Plazenta stammenden kleinen extrazellulären Vesikeln in Mäuse zur Untersuchung der BHS-Störung

Um kleine extrazelluläre Vesikel oder SEV-Injektionen in die Maus durchzuführen, verwenden Sie die SEVs, die aus menschlichen Plazenta-Explantaten isoliert und unter hypoxischen und normoxischen Bedingungen kultiviert wurden. Verdünnen Sie 200 Mikrogramm plazentarer SEVs in Phosphatpuffer bei pH 7,4 bis zu einem Endvolumen von 70 Mikrolitern. Beurteilen Sie vor der Injektion das Wohlbefinden des Tieres anhand der RMCBS-Skala.

Injizieren Sie dann mit einer Insulinspritze mit einer 30-Gauge-Nadel die Lösung in die äußere Halsvene der ordnungsgemäß anästhesierten Maus. Üben Sie nach der Injektion 15 Sekunden lang mit einem trockenen Wattestäbchen leichten Druck auf die injizierte Stelle aus. Beurteilen Sie das Wohlbefinden der Mäuse mit der RMCBS-Skala drei, sechs, 12 und 24 Stunden nach der Injektion.

Für die Analyse der Evansblau-Extravasation wird eine 2%ige Evansblau-Farbstofflösung in PBS hergestellt. 24 Stunden nach der Injektion von SEVs mit retroorbitalem Zugang Evansblau in die ordnungsgemäß anästhesierte Maus injizieren. Sobald Evansblau im Körper des Tieres zirkuliert, führen Sie eine intrakardiale Perfusion an der anästhesierten Maus mit etwa drei Millilitern Kochsalzlösung durch, um den Farbstoff aus dem Kreislauf zu entfernen.

Nachdem Sie die Maus mit einer intrakardialen Infusion von 4%Paraformaldehyd in BBS fixiert und das Gehirn vorsichtig extrahiert haben, wiegen und fotografieren Sie es. Entnehmen Sie nach dem gezeigten Verfahren die Gehirne von den Tieren in jeder Gruppe. Visualisieren Sie mit einem Stereo-Zoom-Mikroskop die Aufnahmebilder der präparierten Hirnschnitte.

Verwenden Sie die aufgenommenen Bilder, um die Extravasation des Evans-Blaus mit der ImageJ-Software zu quantifizieren. Im Gegensatz zu Mäusen, denen SEVs aus normoxischen Plazenten injiziert wurden, zeigten Mäuse, denen SEVs aus hypoxischen Plazenten injiziert wurden, bis 24 Stunden nach der Injektion eine fortschreitende Abnahme des neurologischen Scores. Gehirne von Mäusen, denen SEVs aus hypoxischen Plazenten injiziert wurden, wiesen eine höhere Evans-blaue Extravasation auf als Gehirne von Tieren, denen SEVs aus normoxischen Plazenten injiziert wurden.

Gehirne von Mäusen, denen SEVs aus hypoxischen Plazenten injiziert wurden, zeigten reduzierte Mengen des CLDN5-Proteins, das für die Dichtheit der Blut-Hirn-Schranke entscheidend ist. Alle diese Ergebnisse deuteten auf eine Störung der Blut-Hirn-Schranke hin, die durch SEVs aus hypoxischen Plazenten eingeführt wurde.