Beginnen Sie mit der chemischen Modifizierung der gepoolten Proteinfraktionen durch reduktive Methylierung. Nehmen Sie dazu das gereinigte Protein und fügen Sie 20 Millimolar Dimethylamin Boran hinzu, gefolgt von 40 Millimolar Formaldehyd. Die Mischung zwei Stunden lang bei vier Grad Celsius in einem oszillierenden Schüttler inkubieren.
Dann fügen Sie der Mischung zusätzliche 10 Millimolar Dimethylaminboran hinzu. Anschließend wird die Mischung über Nacht für 12 bis 18 Stunden bei vier Grad Celsius inkubiert. Die Reaktion wird durch Zugabe von 100 Millimolar Trischlorid mit einem pH-Wert von 7,5 gelöscht.
Verwenden Sie den geeigneten Waschpuffer und Elutionspuffer, um das methylierte Protein auf eine Nickel-NTA-Säule zu laden. Waschen Sie zunächst die zwei Milliliter Nickel-NTA-Säule mit 10 Säulenvolumina Waschpuffer. Und dann eluieren Sie das Protein mit dem Elutionspuffer.
Nach der Elution wird das Proteineluat durch eine PD-10-Entsalzungssäule geleitet, die mit dem entsprechenden Puffer voräquilibriert ist. Dem entsalzten Protein wird in Isopropanol oder Ethanol zubereitetes Cholesterin zugegeben und die Mischung über Nacht bei vier Grad Celsius inkubiert. Am nächsten Morgen wird die Mischung bei 150.000 G 10 Minuten lang bei vier Grad Celsius ultrazentrifugiert.
Der gesammelte Überstand wird in einen Zentrifugalkonzentrator mit einem Grenzwert von 100 Kilodalton gegeben und auf eine Endkonzentration von 30 bis 50 Milligramm pro Milliliter konzentriert. Zentrifugieren Sie das konzentrierte Protein erneut mit einer gekühlten Hochgeschwindigkeitszentrifuge und entfernen Sie das Pellet. Legen Sie den gesammelten Überstand bei vier Grad Celsius auf das Eis, bevor Sie mit dem Einstellen der Kristallisation fortfahren.
Alkylierte Proteine, die bei vier Grad Celsius gelagert wurden, wurden über einen Monat hinweg mittels analytischer Gelfiltrationschromatographie analysiert. Und es zeigte sich nach einer Woche ein leichter Proteinverlust.
