Zu Beginn werden die Adenokarzinomzellen des Magens mit TMEM200A Si-RNA transfiziert und zwei Tage lang inkubiert. Entsorgen Sie dann das Zellkulturmedium aus den Vertiefungen und waschen Sie die Zellen vorsichtig zweimal mit einem Milliliter PBS. Legen Sie die Zellen auf Eis und fügen Sie 150 Mikroliter vorgekühlten Radioimmunpräzipitations-Assay-Lysepuffer hinzu.
Lösen Sie mit einem Kunststoff-Zellschaber vorsichtig die anhaftenden Zellen von der Schale und überführen Sie die Zelllösung vorsichtig in ein vorgekühltes Mikrozentrifugenröhrchen. Dann zentrifugiert man das Zelllysat bei 1,5 mal 10 G, das 10 Minuten lang bei vier Grad Celsius auf die Potenz vier G angehoben wird, und überführt den Überstand in ein neues 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen. Bestimmen Sie mit einem BCA-Protein-Assay-Kit den Proteingehalt gemäß den Anweisungen des Herstellers.
Laden Sie 30 Gramm Protein aus jeder Probe auf ein 10%SDS-PAGE-Gel. Lassen Sie das Gel 0,5 Stunden lang bei 80 Volt laufen, gefolgt von 1,5 Stunden bei 120 Volt. Anschließend werden die Proteine aus dem Gel mit einem konstanten Strom von 300 Milliampere für 1 bis 1,5 Stunden auf eine 45-Mikrometer-PVDF-Membran übertragen.
Legen Sie die PVDF-Membran für drei Zyklen à fünf Minuten auf einen Schüttler. Nach dem Schütteln TBST mit der Proteinseite nach oben in den Behälter geben. Legen Sie die Membran für 30 Minuten bei Raumtemperatur in den Blockierungspuffer.
Waschen Sie die Membran mit TBST für drei Zyklen à 10 Minuten. Inkubieren Sie die Membran über Nacht bei vier Grad Celsius mit Primärantikörpern. Nach dreimaligem Waschen der Membran mit TBST wird ein Sekundärantikörper von Kaninchen oder Mäusen zugegeben und eine Stunde lang bei Raumtemperatur inkubiert.
Geben Sie dann 30 Sekunden lang ECL-Substrat auf die PVDF-Membran und detektieren Sie das Signal mit einem Bildgebungssystem. Die Effizienz von TMEM200A war in der mit Si-RNA transfizierten Magenkrebszelle HGC-27 im Vergleich zu den nicht transfizierten Zellen signifikant reduziert. Die TMEM200A Si-RNA hemmte signifikant die verwandten Proteine in der epithelialen mesenchymalen Transition und beeinflusste die Phosphorylierung von AKT im Phosphoinositid-3-Kinase-Signalweg.
