Entnehmen Sie zunächst die getrocknete extrazelluläre Vesikelprobe, die aus dem menschlichen Urin gewonnen wird, mit dem EV-Trap-Ansatz. Bereiten Sie einen frischen Lysepuffer mit den gezeigten Komponenten vor. Dann fügen Sie 100 Mikroliter Lysepuffer hinzu, um die getrocknete EV-Probe zu lösen.
Erhitzen Sie die Probe 10 Minuten lang bei 95 Grad Celsius und schütteln Sie sie dabei mit 1.100 U/min. Nachdem Sie die Probe auf Raumtemperatur abgekühlt haben, verdünnen Sie sie um das Fünffache, indem Sie 400 Mikroliter 50 Millimolar TEAB hinzufügen. Messen Sie die Proteinkonzentration mit einem BCA-Assay-Kit gemäß den Anweisungen des Herstellers.
Die Probe wird mit einer Mischung aus Trypsin und Lysin C vermischt und über Nacht bei 37 Grad Celsius unter Schütteln bei 1.100 U/min inkubiert. Dann fügen Sie 50 Mikroliter 10%ige Trifluoressigsäure oder TFA hinzu, um die Probe anzusäuern. Des Weiteren werden 600 Mikroliter Ethylacetat zu den Proben gegeben und die Mischung zwei Minuten lang gewirbelt.
Zentrifugieren Sie die Probe drei Minuten lang bei 20.000 G und entfernen Sie vorsichtig die obere Schicht, ohne die Grenzfläche zu stören. Trocknen Sie die wässrige Phase mit einem Vakuumzentrifugenkonzentrator. Resuspendieren Sie nun die getrocknete Probe in 200 Mikroliter 0,1%TFA, um Peptide anzusäuern.
Um die Probe zu entsalzen, verwenden Sie eine CA18-Entsalzungsspitze und konditionieren Sie sie mit 200 Mikrolitern 0,1 % TFA und 80 % Acetonitril, gefolgt von zwei Wäschen mit 200 Mikrolitern 0,1 % TFA. Laden Sie die angesäuerte Peptidprobe in die Spitze und waschen Sie sie dreimal mit 200 Mikrolitern 0,1 % TFA. Die Peptide werden mit 200 Mikrolitern 0,1 % TFA und 80 % Acetonitril eluiert.
Nach dem Ziehen des Eluenten wie gezeigt wird die getrocknete Phosphoproteomik-Probe in 200 Mikroliter Ladepuffer für die Phosphopeptidanreicherung resuspendiert. Geben Sie 50 Mikroliter der Kügelchen in die Probe und schütteln Sie sie 20 Minuten lang bei Raumtemperatur. Die Probe mit den Kügelchen in die Frittenspitze geben und eine Minute lang bei 100 g zentrifugieren. Die Spitze nacheinander mit 200 Mikrolitern Ladepuffer waschen, wobei die Puffer eins und zwei gewaschen werden.
Legen Sie die Spitze mit den Kügelchen in ein neues Röhrchen, um die entwichenen Phosphopeptide aufzufangen. Geben Sie 50 Mikroliter Elutionspuffer in die Spitze und zentrifugieren Sie sie zwei Minuten lang bei 20 G. Trocknen Sie dann die ausgetretenen Phosphopeptide mit einem Vakuumzentrifugenkonzentrator.
