Zu Beginn werden Proteom- und Phosphoproteomproben der extrazellulären Vesikel, die aus den Urinproben isoliert wurden, mit dem EVtrap-Ansatz vorbereitet. Injizieren Sie die Proben über das Flüssigkeitschromatographiesystem in das Flugzeit-Massenspektrometer mit gefangener Ionenmobilität. Trennen Sie die Peptide in eine 15 Zentimeter große C18-Säule.
Für die Proteomik-Analyse werden Daten mit der dia-PASEF-Methode mit einem Massenbereich pro Rampe von 300 bis 1200 Masse-zu-Ladungs-Verhältnis und einer Ionenmobilitätskonstante von 0,6 bis 1,50 1/Knoten erfasst. Für die Phosphoproteomik-Analyse werden Daten mit einer dia-PASEF-Erfassungsmethode erfasst. Stellen Sie den Massenbereich pro Rampe auf einen Bereich von 400 bis 1550 ein, das Masse-zu-Ladungs-Verhältnis in der Ionenmobilitätskonstante von 0,6 bis 1,50 1/Knoten.
Laden Sie die Rohdateien in die Proteomik-Software. Richten Sie die Suchparameter in der Homo sapiens-Datenbank ein. Wählen Sie für Digest Type die Option Specific (Spezifisch) und unter Enzyme (Enzyme) die Option TrypsinP (TrypsinP) aus.
Definieren Sie die Peptidlänge auf mindestens 7 und maximal 52 und lassen Sie zwei verpasste Spaltungen zu. Legen Sie dann die maximale Anzahl von Variablenänderungen auf 5 fest. Die feste Modifikation sollte Carbamidomethyl an Cystin sein, während die variablen Modifikationen Acetylprotein N-terminal, Oxidation an Methionin und Phosphorylierung an Serin, Threonin und Tyrosin umfassen sollten.
Legen Sie abschließend die False-Discovery-Rate für die Peptidspektrum-Übereinstimmung, das Peptid und die Proteingruppe auf 0,01 fest. Im LCMS- und MS-Proteom-Profiling zeigten 2 % jeder Probe über 11.000 einzigartige Peptide aus etwa 2.200 Proteinen. Bemerkenswert ist, dass 72 % der einzigartigen Proteine konsistent in allen drei Replikaten gefunden wurden und 90 Top-EV-Marker und -Proteine im Vergleich zur ExoCarta-Datenbank identifiziert wurden.
Die quantitative Präzision wurde mit einem niedrigen bis mittleren Variationskoeffizienten von 5,7 % bestätigt, was eine hohe Reproduzierbarkeit und Zuverlässigkeit bedeutet. Für die Phosphoproteomik ergaben 98 % jeder Peptidprobe 800 einzigartige Phosphopeptide und 350 Phosphoproteine. Die Anreicherung ergab 72 % Phosphoserin, 22 % Phosphothreonin und 6 % Phosphotyrosin-Peptide.
42 % der Phosphopeptide wurden in allen Replikaten mit einem mittleren Variationskoeffizienten von 21,8 % identifiziert, was auf eine akzeptable quantitative Reproduzierbarkeit hindeutet.
