Mit einer serologischen Pipette vorsichtig vier Milliliter heparinisiertes menschliches Blut über acht Milliliter Dichtegradientenmedium in ein 15-Milliliter-Zentrifugenröhrchen schichten. Zentrifugieren Sie das Blut bei 550 g für 30 bis 50 Minuten bei 20 Grad Celsius. Entfernen Sie dann mit einer Ein-Milliliter-Pipette die obere Schicht mit Plasma und mononukleären Zellen.
Sammeln Sie Neutrophile aus dem unteren trüben Band und etwa drei bis vier Milliliter unterhalb der klaren Flüssigkeit in ein 15-Milliliter-Zentrifugenröhrchen, das 10 Milliliter PBS enthält. Drehen Sie das Röhrchen vorsichtig zwei- bis dreimal um, um die neutrophile Suspension zu mischen. Zentrifugieren Sie die Neutrophilensuspension bei 400 G für 10 Minuten bei 20 Grad Celsius, dann dekantieren Sie vorsichtig den Überstand aus dem Röhrchen und resuspendieren Sie das Pellet in fünf Millilitern PBS.
Auch hier zentrifugieren Sie die Suspension bei 300 G für 10 Minuten bei 20 Grad Celsius. Nachdem Sie den Überstand entfernt haben, verwenden Sie eine Vakuumabsaugung, um Restüberstände an der Rohrwand und um die Röhrchenmündung herum zu entfernen. Resuspendieren Sie das Pellet in einem Milliliter neutrophilem Medium.
Kombinieren Sie einen Milliliter 1,2 Mikrogramm pro Milliliter Antikörperlösung mit 0,2 Milliliter neutrophilem Medium in einem 1,5-Milliliter-Röhrchen. Geben Sie 25 Mikroliter Antikörperlösung in die Negativkontrollvertiefungen in einer 384-Well-Platte. In einem 15-Milliliter-Röhrchen werden neun Milliliter der Antikörperlösung, 21,6 Mikroliter der FMLP-Lösung und 1,7784 Milliliter neutrophiles Medium vermischt.
Geben Sie 25 Mikroliter dieser Mischung in die Positivkontrolle und testen Sie die Vertiefungen in einer 384-Well-Platte. Übertragen Sie mit einer Mehrkanalpipette fünf Mikroliter Verbindungslösung von der Verbindungsbibliotheksplatte auf die 384-Well-Platte. Zentrifugieren Sie die Suspension bei 500 g für eine Minute.
Geben Sie 20 Mikroliter Neutrophilensuspension mit einer 16-Kanal-Pipette in jede Vertiefung. Die Platte auf einem Shaker bei 300 U/min 10 Minuten lang inkubieren. Um die Zellen zu fixieren, fügen Sie drei Mikroliter 16%iges Paraformaldehyd in jede Vertiefung hinzu und inkubieren Sie 10 Minuten lang auf Eis.
