Zu Beginn legen Sie das HBSS-Zelldissoziationsreagenz EGM-2 und DMEM für 10 bis 15 Minuten in ein 37 Grad Celsius warmes Wasserbad. Thrombin und Laminin über Nacht bei 4 Grad Celsius und Fibrinogen bei Raumtemperatur auftauen. Geben Sie 1,5 Mikroliter Thrombin in ein 500-Mikroliter-Mikrozentrifugenröhrchen.
Legen Sie eine UV-sterilisierte Hochdurchsatzplatte für 30 Minuten in einen Exsikkator, um die in der Mikrofluidik eingeschlossene Luft zu entfernen. Legen Sie den T75-Kolben bei 4-facher Vergrößerung unter das Mikroskop, um die Zellkonfluenz und Transduktionseffizienz zu bestätigen. Waschen Sie die Zellen zweimal mit fünf Millilitern HBSS.
Dann wird ein Milliliter Dissoziationsreagenz in den Kolben gegeben und bei 37 Grad Celsius mit 5%igem Kohlendioxid für ein bis zwei Minuten inkubiert. Klopfen Sie vorsichtig mit der Handfläche auf den Kolben und beobachten Sie unter dem Mikroskop, dass alle Zellen angehoben wurden. Waschen Sie die Zellen mit neun Millilitern geeigneter Medien und sammeln Sie die Suspension in einem konischen 15-Milliliter-Röhrchen.
Entfernen Sie sofort ein kleines Aliquot und zählen Sie die Zellen. Zentrifugieren Sie die Zellsuspension bei 300 G und vier Grad Celsius für drei bis fünf Minuten. Entfernen Sie dann den Überstand und suspendieren Sie das Pellet in geeigneten Medien auf Eis.
Berechnen Sie anhand der angegebenen Gleichung die Anzahl der benötigten Zellen. Resuspendieren Sie die Zellen bei einer Konzentration von 1 mal 10 bis 6 Zellen pro Milliliter und berechnen Sie das benötigte Zellvolumen mit der folgenden Gleichung. Zentrifugieren Sie das erforderliche Volumen der Zellsuspension wie gezeigt.
Dann wird das Pellet in einem berechneten Volumen von Fibrinogen auf Eis resuspendiert.
