Legen Sie zunächst die UV-sterilisierten Hochdurchsatzplatten und Thrombin-Aliquots in die Gewebekulturhaube ein. Die vorbereitete Zellfibrinmischung auf Eis legen, um die Gerinnung zu verlangsamen. Ziehen Sie mit einer P20-Pipette sechs Mikroliter der Zellfibrinmischung ab.
Setzen Sie dann die Pipettenspitze vorsichtig in das Thrombin-Aliquot ein und mischen Sie zweimal, ohne Luftblasen einzubringen. Heben Sie die Hochdurchsatzplatte schräg an und stecken Sie die Pipettenspitze schnell in eine der Ladeöffnungen. Schieben Sie den Pipettenkolben in einer sanften und flüssigen Bewegung bis zum ersten Anschlag und injizieren Sie die Zellfibrinmischung in die Gewebekammer.
Stellen Sie sicher, dass das Gel die Kammer vollständig durchquert. Legen Sie die Platte vorsichtig flach auf, ohne die Pipettenspitze zu entfernen oder die Pipette zu verschieben. Entfernen Sie die Pipettenspitze mit einer Hand vom P20 und lassen Sie sie im Ladeloch.
Nach zwei Minuten entfernen Sie die Pipettenspitzen mit sanften Drehbewegungen aus den Ladeöffnungen und legen den Deckel auf die Platte. Inkubieren Sie die Platte für 15 bis 20 Minuten bei 37 Grad Celsius für die Gelpolymerisation. Platzieren Sie das mikrofluidische Gerät auf dem Mikroskoptisch, um die gleichmäßige Verteilung der Zellen in der Kammer ohne Luftblasen zu beobachten.
Führen Sie die Pipettenspitze P20 in M1 oder M3 ein und stoßen Sie langsam vier Mikroliter Laminin aus, um die gesamte Deckplatte zu beschichten. Entfernen Sie die Pipettenspitze wie zuvor gezeigt und inkubieren Sie die Platte bei 37 Grad Celsius in 5%igem Kohlendioxid für 10 Minuten. Geben Sie 275 Mikroliter EGM-2-Komplettmedium in die entkoppelten Reservoirs der Wells, die sich in den Reihen A und B befinden.Stecken Sie die Pipettenspitze P200 in das Medieneinlassloch der Wells, die 275 Mikroliter EGM-2 enthalten, und stoßen Sie langsam 75 Mikroliter Medium aus, während Sie beobachten, wie das Medium durch den Kanal wandert und auf der anderen Seite nach oben sprudelt.
Nachdem Sie die Pipettenspitze entfernt haben, schieben Sie das verbleibende Medium von der Spitze in das Medienreservoir. Fügen Sie 50 Mikroliter Medien hinzu, um die unteren Seitenvertiefungen in den Reihen G und H vollständig zu bedecken. Inkubieren Sie die Platten ein bis zwei Stunden lang, wie gezeigt. Identifizieren Sie unter dem Mikroskop alle Blasen in den Medienkanälen und entfernen Sie sie, indem Sie 75 Mikroliter Medien wieder in die Kanäle einführen.
Prüfen Sie die Ein- oder Auslässe des Mediums mit bloßem Auge auf Luftblasen. Führen Sie dann die P200-Pipettenspitze in das Loch ein und ziehen Sie die Blase heraus, indem Sie den Kolben anheben. In vaskularisierten Mikroorganen oder VMOs verteilten sich die Endothelzellen zunächst gleichmäßig in der Gewebekammer, aber am zweiten Tag begannen sie, sich auszudehnen und zu leuchten.
Am vierten Tag anastomosierten die Endothelzellen mit den äußeren mikrofluidischen Kanälen und bildeten ein kontinuierliches Gefäßnetzwerk. Die Funktion der engen vaskulären Barriere wurde durch die Perfusion von FITC-Dextran durch das mikrovaskuläre Netzwerk mit minimaler Leckage bestätigt. Die Perfusion von MDA-MB-231-Krebszellen in die VMOs führte zu deren Anhaftung an der Endothelauskleidung und anschließender Extravasation in den extrazellulären Raum, wobei innerhalb von 24 Stunden nach der Perfusion mehrere Mikrometastasen gebildet wurden.
Durch mikroskopische Bildgebung im Zeitraffer wurde die Extravasation von T-Zellen in den extrazellulären Raum der VMOs über 45 Minuten beobachtet. In vaskularisierten Mikrotumoren mit voll ausgebildeten Gefäßen haften T-Zellen nach der Perfusion schnell an der Gefäßwand.
