Um mit der Verwendung einer serologischen Pipette zu beginnen, entfernen Sie das Wachstumsmedium aus dem T75-Kolben, der 70 % konfluente MDA-MB-231-Kultur enthält. Drei Milliliter Trypsin in den Kolben geben und bei 37 Grad mit 5%igem Kohlendioxid drei bis fünf Minuten lang inkubieren, um die Zellen vom Kolben zu lösen. Um dann das Trypsin zu neutralisieren, geben Sie drei Milliliter DMEM in den Kolben.
Die Zellsuspension wird in einem Zentrifugenröhrchen aufgefangen und vier Minuten lang bei 400 g geschleudert. Verwerfen Sie den Überstand mit einer Pipette und resuspendieren Sie das Pellet in zwei Millilitern PBS. Bestimmen Sie mit einem Zellzähler die Zellkonzentration.
Acht mal 10 auf die fünften Zellen in ein 15-Milliliter-Röhrchen geben und PBS hinzufügen, um das Volumen auf einen Milliliter zu erhöhen. Geben Sie dann zwei Mikroliter CFSE in das Röhrchen und mischen Sie die Zellsuspension gründlich mit einer Ein-Milliliter-Pipette. Stellen Sie das Röhrchen 20 Minuten lang auf einen Inkubator mit 37 Grad Celsius und 5 % Kohlendioxid.
Als nächstes geben Sie fünf Milliliter DMEM in das Röhrchen und zentrifugieren Sie, um die CFSE-markierten Zellen zu pelletieren. Verwerfen Sie den Überstand und resuspendieren Sie das Pellet in einem Milliliter DMEM. Nach einer erneuten Bewertung der Zellkonzentration werden viermal 10 bis zur fünften Zelle in ein 25-Milliliter-Reagenzreservoir überführt.
Fügen Sie DMEM hinzu, um das Volumen auf acht Milliliter zu erhöhen, und mischen Sie die Zellsuspension mit einer serologischen Pipette von fünf Millilitern. Übertragen Sie mit einer Mehrkanalpipette 100 Mikroliter Zellsuspension in jede Reihe auf der linken Hälfte einer schwarzen 96-Well-Platte. In ähnlicher Weise fügen Sie die EGFR-Knockout-Zellsuspension auf die rechte Hälfte der Platte hinzu.
Um eine gleichmäßige Zellverteilung zu gewährleisten, bewegen Sie die Platte auf der Plattform hin und her und von einer Seite zur anderen. Inkubieren Sie die Platte vier Stunden lang bei 37 Grad Celsius und 5 % Kohlendioxid, damit sich die Tumorzellen anheften können. Basierend auf der Anzahl der nicht transduzierten und CAR-exprimierenden Jurkat-Zellen werden viermal 10 in die fünften CAR-J-Zellen in ein 25-Milliliter-Reservoir überführt.
DMEM bis zu einem Endvolumen von zwei Millilitern in den Behälter geben. Für ein Effektor-zu-Tumor-Verhältnis von 4:1 werden zwei mal 10 zu den vierten CAR-J-Zellen pro Well in 100 Mikroliter Medium entlang der Seite des Wells hinzugefügt, ohne die anhaftenden Tumorzellen zu stören. Geben Sie dann 100 Mikroliter DMEM an die Seite der Vertiefungen, die Tumor- und Jurkatzellen enthalten, um 300 Mikroliter Volumen pro Vertiefung zu erhalten.
Bewegen Sie die Platte wie gezeigt, um eine gleichmäßige Verteilung der Jurkat-Zellen auf den Tumorzellen zu gewährleisten. Lassen Sie die Co-Kultur 48 Stunden lang bei 37 Grad Celsius mit 5 % Kohlendioxid einwirken.
