Nach der Co-Kultivierung von CAR, die Jurkats exprimieren, mit CFSE-markierten Tumorzellen wird die Platte vorsichtig auf ein Papiertuch gelegt und die CAR-J-haltigen Überstände geklopft, um sie zu verwerfen. Geben Sie mit einer Mehrkanalpipette 100 Mikroliter FluoroBrite DMEM-Medien mit Propidiumjod oder PI in die Vertiefungen, ohne die anhaftenden Tumorzellen zu stören. Geben Sie dann 20 Mikroliter 20%Triton X in die erste Vertiefung jedes Tumortyps und dienen Sie als vollständige Totkontrolle.
Inkubieren Sie die Platte 20 Minuten lang bei 37 Grad Celsius und 5 % Kohlendioxid, bevor Sie sie bebildern. Verwenden Sie nach der Fluoreszenzbildgebung einen der reinen Tumor-Wells der Zellen, um den grünen Fluoreszenzkanal zu kalibrieren. Um Zellen am Rand der Wells auszuschließen, verringern Sie die Well-Maske auf 98 %Identifizieren Sie CFSE-markierte Tumorzellen auf dem grünen Fluoreszenzkanal und passen Sie den Schwellenwert für die Fluoreszenzintensität an, um alle Zellen im Well zu erfassen.
Stellen Sie den minimalen Zelldurchmesser auf 25 Mikrometer ein, um im CFSE-Kanal erkannte Ablagerungen auszuschließen. Aktivieren Sie dann separate Berührungsobjekte, um einzelne Zellen zu identifizieren. Legen Sie als Nächstes Gatter fest, um lebende und tote Zellpopulationen zu definieren.
Wählen Sie die CFSE-markierten Zellen aus, und generieren Sie ein Histogramm der Anzahl auf der y-Achse im Vergleich zur mittleren PI-Intensität auf der x-Achse. Passen Sie den Wert der x-Achse an, um die Zellen besser zu visualisieren, und zeichnen Sie einen Splitter, um zwischen Zellen mit niedrigem PI und Zellen mit hoher PI-Färbung zu unterscheiden. Kennzeichnen Sie die mit niedrigem PI gefärbten Zellen als lebende Zellen.
Legen Sie als Nächstes ein weiteres Histogramm für lebende Zellen fest, wobei sich die Fläche auf der X-Achse und die Anzahl auf der Y-Achse befindet. Kennzeichnen Sie die Nicht-Trümmerzellen als große lebende Zellen. Zeichnen Sie dann einen weiteren Splitter, indem Sie nur den Tumor gut verwenden, um Zellen einzufangen und Trümmer herauszufiltern.
Nachdem Sie die Analyse für die gesamte Platte durchgeführt haben, exportieren Sie die Tabelle mit den Zahlen. Tragen Sie die Anzahl der großen Zellen auf, um die Anzahl der lebenden CFSE-markierten Tumorzellen zu bestimmen, die nach der Exposition gegenüber CAR-J im Well verbleiben. Führen Sie abschließend statistische Analysen mit unidirektionaler ANOVA durch.
Die Zytotoxizität von CAR-J1 stieg mit einem höheren Effektor-zu-Tumor-Verhältnis und eine Abtötung von mehr als 50 % wurde bei einem Effektor-zu-Tumor-Verhältnis von vier zu eins beobachtet. EGFR-gerichtete CAR-Konstrukte mit modifizierten Scharnierdomänen zeigten eine antigenspezifische Abtötung gegen EGFR-exprimierende MDA-MB-231-Zellen, und es wurde keine signifikante Abtötung gegen EGFR-Knockout-Zellen beobachtet. CAR-Konstrukte wurden auch auf PBMC-abgeleiteten CD3-T-Zellen exprimiert.
Es gab jedoch keine Expression von CD8-Scharnier-haltigem EGFR-CAR. Der IgG-Kurzfilm zeigte die geringste zytotoxische Potenz gegen MDA-MB-231-Zellen im Vergleich zum IgG-Lang- und IgG-Medium.
