SWITCH - H2O2 - Antigen Retrieval - TDE (SHORT) Tissue Transformation Technique

Beginnen Sie damit, die formalinfixierten, in Paraffin eingebetteten Hirnabschnitte in Schalen mit Schraubdeckeln zu legen. Die Abschaltlösung auf das Geschirr auftragen, mit Alufolie abdecken und bei vier Grad Celsius unter Schütteln einen Tag lang inkubieren. Am nächsten Tag werden alle Proben in neue Schalen überführt und mit der zuvor gezeigten Einschaltlösung inkubiert.

Am Ende der Inkubation werden die Proben in Röhrchen gegeben und zwei Stunden lang dreimal mit PBS gewaschen, während sie geschüttelt werden. Anschließend wird den Proben eine Inaktivierungslösung zugesetzt und über Nacht in einem bei 37 Grad Celsius eingestellten Wasserbad inkubiert. Nach drei Wäschen wird den Proben Reinigungslösung zugesetzt und drei bis sieben Tage lang in einem 55 Grad Celsius warmen Wasserbad inkubiert.

Am Ende der Inkubation werden die Proben mit PBST bei 37 Grad Celsius für drei Stunden in einem Inkubator gewaschen. Am nächsten Tag fügen Sie jeder Probe 10 Milliliter 30%iges Wasserstoffperoxid hinzu und waschen Sie die Proben dreimal 10 Minuten lang mit PBS, während Sie bei Raumtemperatur geschüttelt werden. Anschließend wird die Antigen-Rückgewinnungslösung im Wasserbad auf 95 Grad Celsius vorgewärmt.

Die Proben werden in die erhitzte Lösung überführt und 10 Minuten lang bei 95 Grad Celsius inkubiert, gefolgt von 40 Minuten bei Raumtemperatur auf einem Schüttler. Waschen Sie die Proben fünf Minuten lang mit deionisiertem Wasser und schütteln Sie sie. Äquilibrieren Sie die Stichproben in PBS.

Füllen Sie nun die Proben in Schalen mit Schraubdeckel um. Nachdem Sie eine frische Primärantikörperlösung für alle Proben in einem Becherglas hergestellt haben, geben Sie diese zu den Proben und inkubieren Sie sie ein bis sieben Tage lang bei 37 Grad Celsius unter leichtem Schütteln im Dunkeln. Anschließend werden die Proben in Röhrchen gegeben und mit vorgewärmtem PBST bei 37 Grad Celsius im Inkubator gewaschen.

Bringen Sie die Proben in Schalen mit Schraubdeckeln und fügen Sie Sekundärantikörper hinzu, die in PBST und 0,01 % Natriumazid hergestellt wurden. Die Proben werden in Röhrchen umgefüllt und mit vorgewärmtem PBST dreimal bei 37 Grad Celsius für zwei Stunden gewaschen und dabei geschüttelt. Für die Brechungsindexanpassung werden die Proben in neue Schalen gegeben und 30%ige TDE-Lösung hinzugefügt.

Ersetzen Sie dann 30 % TDE durch 68 % TDE-Lösung in den Proben und lassen Sie sie unter Schütteln bei Raumtemperatur. Nach der kurzen Verarbeitung wurde eine optimale und homogene Transparenz aller Gewebeschnitte sowohl in der grauen als auch in der weißen Substanz erreicht.