Um mit der Knochenmarkentnahme zu beginnen, weichen Sie eine euthanasierte Ratte in 75% Ethanol ein, um das Fell und die Haut zu sterilisieren. Legen Sie die Ratte auf den Rücken und trennen Sie die unteren Gliedmaßen an der Hüfte ab, um den Oberschenkelkopf zu schützen. Verwenden Sie eine Präparierschere, um das Band am Sprunggelenk zu durchtrennen.
Falten Sie dann das Kniegelenk nach hinten, um den Oberschenkelknochen und das Schienbein freizulegen. Entfernen Sie vorsichtig mit einer Pinzette und einer Schere alle Muskeln, Sehnen und anderes Gewebe, das mit den Knochen verbunden ist. Stechen Sie das Mark mit einer 5-Millimeter-Nadelspritze durch beide Knochenenden, um die Markmatrix zu lösen.
Verwenden Sie nun eine frische Spritze, um das Knochenmark mit 10-15 Millilitern RPMI-Medien auszuspülen. Zentrifugieren Sie die Knochenmarkzellen bei 300 g für 10 Minuten bei 20 Grad Celsius. Entsorgen Sie den Überstand und resuspendieren Sie die Zellen in 5-10 Millilitern Lysepuffer für rote Blutkörperchen.
Fügen Sie der Mischung nach dem Inkubieren der Suspension das vierfache Volumen von HBSS hinzu. Dann zentrifugieren Sie die Zellen fünf Minuten lang bei Raumtemperatur bei 600 g. Verwenden Sie das resultierende Pellet zur weiteren Verwendung.
Isolieren Sie die Neutrophilen zuerst mit dem Rattenknochenmark-Neutrophilen-Isolationskit. Schichten Sie 2 Milliliter 80-55% pro col Reagenz in ein 15 Milliliter Zentrifugenröhrchen, um einen Dichtegradienten zu erzeugen. Pipettieren Sie dann die isolierten Neutrophilen oder die Resuspensionslösung von Zellen, die mit dem Rattenknochenmark-Neutrophilen-Isolationskit isoliert wurden, in das Röhrchen.
Zentrifugieren Sie das Röhrchen bei 800 g 40 Minuten lang bei 20 Grad Celsius. Sammeln Sie mit einer sterilen Pipette die 70%-Gradientenschicht, einschließlich der Zellschichten an der 65-70%-Grenze. Übertragen Sie die Zellsuspension in ein neues 15-Milliliter-Zentrifugenröhrchen.
Geben Sie 15 Milliliter HBSS in das Röhrchen und drehen Sie es vorsichtig um, um den Inhalt zu mischen. Zum Schluss zentrifugieren Sie das Röhrchen bei 300 g 10 Minuten lang bei Raumtemperatur, um die Zellen zu pelletieren. Für den einstufigen Prozess zentrifugieren Sie nach dem Pipettieren der Knochenmarksuspension direkt in das Dichtegradientenröhrchen wie zuvor gezeigt.
Pipettieren Sie als Nächstes die 70%-Gradientenschicht heraus, einschließlich der Schichten an der 75-70%-Gradientengrenze. Übertragen Sie diese Zellsuspension in ein neues 50-Milliliter-Zentrifugenröhrchen mit 10 Millilitern HBSS. Dann zentrifugieren Sie das Röhrchen fünf Minuten lang bei Raumtemperatur bei 400 g, um die Zellen zu pelletieren.
Zählen Sie die isolierten Neutrophilen mit einem Hämozytometer und beurteilen Sie die Lebensfähigkeit der Zellen durch Trypanblau-Färbung. Die zweistufige Methode hatte einen erhöhten Reinheitsgrad von 90 % im Vergleich zu den 50 %, die mit der einstufigen Methode erreicht wurden.
