Zu Beginn resuspendieren Sie die isolierten Rattenneutrophilen in vier Millilitern supplementierter RPMI-Medien in einer sterilen 10-Zentimeter-Petrischale. Als nächstes fügen Sie der neutrophilen Suspension vier Mikroliter PMA hinzu, um die Bildung von NETs auszulösen. Inkubieren Sie die Mischung drei Stunden lang bei 37 Grad Celsius unter 5% Kohlendioxid.
Für die Negativkontrolle fügen Sie der Neutrophilensuspension vier bis fünf Mikroliter DNASE1 hinzu, um die sezernierten NETs abzubauen. Fügen Sie dann vier Milliliter HBSS hinzu, um die NETs zu waschen. Spülen Sie die Platte mit vier Millilitern frischem Nährmedium für jede Platte, um die NETs zu lösen.
Sammeln Sie nun das Waschmedium in einem neuen Röhrchen und pipettieren Sie es häufig, um eine vollständige Resuspension der NETs zu gewährleisten. Die Suspension bei 300 g 10 Minuten bei 20 Grad Celsius zentrifugieren, um alle schwimmenden Zellen zu entfernen. Sammeln Sie dann das überstehende Medium mit NETs in einem neuen Rohr.
Zentrifugieren Sie die Suspension von NETs und schwimmenden Zellen in einer 24-Well-Platte mit 1,4 Zentimeter großen Glasdeckgläsern, um schwimmende Zellen abzusetzen. Befestigen Sie dann die Zellen auf Deckgläsern mit 4 % PFA und überprüfen Sie das Vorhandensein der NETs. Geben Sie als Nächstes einen Tropfen HBSS auf einen mit Paraffinfilm bedeckten Reagenzglasständer.
Drehen Sie den Eindeckbezug in die HBSS-Tröpfchen, um ihn zu waschen. Nach dem Waschen die Zellen in 250 Mikrolitern 0,5x Triton X-100 10 Minuten bei Raumtemperatur inkubieren, um sie zu permeabilisieren. Waschen Sie dann die Zellen dreimal eine Minute lang in HBSS.
Verschließen Sie die Zellen in 10% normalem Eselsserum bei Raumtemperatur für eine Stunde. Schließlich inkubieren Sie die Zellen mit 70 bis 90 Mikrolitern Anti-Ratten-Antikörpern über Nacht bei vier Grad Celsius. Waschen Sie den Deckbezug dreimal für jeweils fünf Minuten in HBSS.
Inkubieren Sie nun das Deckglas in den sekundären Antikörpern bei Raumtemperatur eine Stunde lang im Dunkeln, bevor Sie ein HBSS waschen. Färben Sie die Zellkerne und NETs-Skelette in 70 bis 90 Mikrolitern DAPI. Führen Sie die HBSS-Wäsche dreimal für jeweils fünf Minuten durch.
