Pipettieren Sie zunächst 50 Mikroliter der isolierten Ratten-NET-Proben in ein Röhrchen mit 450 Mikrolitern Tris-EDTA-Puffer. Pipettieren Sie nun 100 Mikroliter der DNA-Standards und die Proben in eine 96-Well-Platte. Geben Sie ein gleiches Volumen des Assay-Reagenzes in die Wells.
Inkubieren Sie die Platte dann zwei bis fünf Minuten lang bei Raumtemperatur und vermeiden Sie direkte Lichteinstrahlung. Legen Sie die Platte in einen Fluoreszenz-Mikroplatten-Reader. Stellen Sie ein Emissionsspektrum von etwa 530 Nanometern und ein Absorptionsspektrum von etwa 480 Nanometern ein.
Inkubieren Sie die Zellen 30 Minuten lang in einem Mikroliter einer Zellkernfärbung. Als nächstes inkubieren Sie die Zellen 10 Minuten lang in einem Mikroliter zellfreiem DNA-Stamm. Mischen Sie die fluoreszierenden Farbstoffe vorsichtig.
Legen Sie die Probenplatte in das Zytometer ein. Wechseln Sie zum SYTOX Green-Kanal und wählen Sie dann den HEXT-Kanal aus. Stellen Sie die Beleuchtung auf Blau 377/447 ein und stellen Sie die Belichtungszeit auf 300.000 Mikrosekunden ein.
Klicken Sie auf Fokussiertes Setup und dann auf Register Auto, um den Fokus automatisch anzupassen. Wählen Sie den SYTOX Green-Kanal und stellen Sie die Beleuchtung auf Green 483/536 ein. Stellen Sie die Belichtungszeit für SYTOX Green auf 30.000 Mikrosekunden ein.
Klicken Sie auf Scan starten, um den Scanvorgang zu starten. Vergleichbare Reaktionen in der NET-Sekretion waren unabhängig von der PMA-Stimulation zwischen peripheren und Knochenmark-Neutrophilen erkennbar. Rattennetze zeigten auch begrenzte Vernetzungsfähigkeiten untereinander.
Die Inkubation mit PMA führte nach vier Stunden zu einem Anstieg des zellfreien DNA-Gehalts um 10 %, was auf eine höhere Neigung zur Auslösung der NET-Bildung hinweist.
