Entfernen Sie zunächst das Rückenmark einer enthaupteten Maus, die mit PBS durchblutet wurde. Tauchen Sie das Rückenmark in kaltes DPBS in einer Petrischale auf Eis. Verwenden Sie eine 18-Gauge-Nadel und eine 10-Milliliter-Spritze, die mit kaltem DPBS gefüllt ist, um das gesamte Rückenmark in einer Laminar-Flow-Haube durch hydraulische Extrusion zu isolieren.
Übertragen Sie das Rückenmark in die Petrischale mit kaltem DPBS, das auf Eisbeutel gelegt wird. Entfernen Sie mit einem Mikroskop in der Laminar-Flow-Haube vorsichtig alle sichtbaren Hirnhäute mit einer scharfen Pinzette. Übertragen Sie dann das Rückenmark in eine leere Petrischale und schneiden Sie es mit einer chirurgischen Skalpellklinge Nr. 10 in zwei bis drei Millimeter lange Abschnitte.
Für die enzymatische Dissoziation der Rückenmarkszellen geben Sie die Enzymmischungen 1 und 2 zu den Rückenmarksstücken. Schwenken Sie die Enzyme in der Schale mehrmals, um eine gleichmäßige Beschichtung des Rückenmarks zu gewährleisten. Die Schale 30 Minuten lang bei 37 Grad Celsius inkubieren und alle 10 Minuten manuell schwenken.
Nach der Inkubation 350 Mikroliter DNA hinzufügen I. Schwenken Sie die Schale vorsichtig, um sie zu mischen. Als nächstes fügen Sie einen Milliliter kaltes DMEM hinzu, das mit 0,5 % FBS ergänzt ist, bevor Sie vorsichtig mischen. Den gesamten Inhalt sofort in ein Fünf-Milliliter-Röhrchen umfüllen.
Mit einer P1000-Pipette das Gewebe dreimal vorsichtig verreiben. Verwenden Sie dann eine verschlossene Pasteurpipette aus Neun-Zoll-Glas, um das Gewebe fünf weitere Male vorsichtig zu verreiben. Stellen Sie das Röhrchen 30 Sekunden lang aufrecht, damit sich das Gewebe setzen kann.
Mit einer P1000-Pipette wird der Überstand abgesaugt und durch einen 30-Mikrometer-Filter in ein konisches 15-Milliliter-Röhrchen überführt. Geben Sie in das Röhrchen mit den restlichen Geweben einen Milliliter FBS-ergänztes DMEM. Dann dreimal vorsichtig mit einer Pasteurpipette verreiben.
Nachdem sich das Gewebe am Boden abgesetzt hat, leiten Sie den Überstand durch einen 30-Mikrometer-Filter und sammeln Sie ihn in demselben 15-Milliliter-Röhrchen, das zuvor verwendet wurde. Die filtrierte Zellsuspension wird bei 300 g 10 Minuten bei Raumtemperatur zentrifugiert. Verwenden Sie einen Vakuumsauger, um den Überstand vorsichtig zu entsorgen.
Verwenden Sie die Lösung zur Entfernung von Ablagerungen, die im Dissoziationskit für das Gehirn von Erwachsenen enthalten ist, um das Myelin aus dem Zellpellet zu entfernen. Geben Sie dann fünf Milliliter FBS-ergänztes DMEM in das Pellet und drehen Sie das Röhrchen zum Mischen dreimal vorsichtig um. Nach dem Zentrifugieren wird der Überstand verworfen und das Zellpellet in einem Milliliter FBS-ergänztem DPBS resuspendiert.
Zentrifugieren Sie erneut, bevor Sie den Überstand verwerfen. Die Zellen wurden mit Anti-ACSA-2 MicroBeads gemäß dem Protokoll des Herstellers markiert. Verwenden Sie die magnetischen Trennsäulen, um die Zellen durch positive Selektion zu trennen.
Dann zentrifugieren Sie die Zellen 10 Minuten lang bei 300 g, bevor Sie den Überstand verwerfen. Als nächstes wird das Zellpellet in einem Milliliter warmem, mit FBS angereichertem DMEM resuspendiert. Übertragen Sie die Zellsuspension in ein Hämozytometer, um die Zellen zu zählen und ihre Lebensfähigkeit zu beurteilen.
Stellen Sie die Zellkonzentration mit FBS DMEM auf 75.000 Zellen pro 50 Mikroliter ein. Anschließend werden 50 Mikroliter der Zellsuspension in ein mit Poly-L-Lysin beschichtetes Deckglas in einer 24-Well-Platte überführt. Inkubieren Sie die Platte zwei Stunden lang bei 37 Grad Celsius, damit die Zellen am Deckglas haften können.
Geben Sie dann vorsichtig 450 Mikroliter warmes und mit Antibiotika angereichertes FBS DMEM in jede Vertiefung. Es wurde eine erfolgreiche Isolierung und Proliferation von Mikroglia und Astrozyten beobachtet. Am vierten Tag wurde beobachtet, dass Astrozyten längere Fortsätze bildeten, während ovale Mikrogliazellen mit kürzeren Spindeln zu sehen waren.
Die Astrozyten bildeten am siebten Tag eine zusammenhängende konfluierende Schicht, wobei die Mikroglia weniger und kürzere Fortsätze zeigten. Die Zellsortierung bestätigte eine Zellviabilität von 92 bis 93 % der isolierten Zellkultur.
