Konservierung von aus humanen embryonalen Stammzellen gewonnenen retinalen Pigmentepithelzellen mit optimierter Kryokonservierung

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November 3rd, 2023

DOI :

10.3791/200824-v

November 3rd, 2023

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Xinyue Bai*¹^,²^,³^,⁴^,⁵^,⁶^,⁷, Ting Zhang*¹^,²^,³^,⁴^,⁵^,⁶^,⁷, Xinyue Zhu¹^,²^,³^,⁴^,⁵^,⁶^,⁷, Xianyu Huang¹^,²^,³^,⁴^,⁵^,⁶^,⁷, Haiyun Liu¹^,²^,³^,⁴^,⁵^,⁶^,⁷, Xiaoyan Ding⁸, Mei Jiang¹^,²^,³^,⁴^,⁵^,⁶^,⁷, Xiaodong Sun¹^,²^,³^,⁴^,⁵^,⁶^,⁷

¹Department of Ophthalmology, Shanghai General Hospital, Shanghai Jiao Tong University School of Medicine, ²National Clinical Research Center for Eye Diseases, ³Shanghai Clinical Research Center for Eye Diseases, ⁴Shanghai Key Clinical Specialty, ⁵Shanghai Key Laboratory of Ocular Fundus Diseases, ⁶Shanghai Engineering Center for Visual Science and Photomedicine, ⁷Shanghai Engineering Center for Precise Diagnosis and Treatment of Eye Diseases, ⁸Stem Cell Core Facility, CAS Center for Excellence in Molecular Cell Science, Chinese Academy of Sciences

* Diese Autoren haben gleichermaßen beigetragen

Transkript

Dissoziieren Sie zunächst die aus hES-Zellen abgeleiteten retinalen Pigmentepithelzellen, bereiten die Zellsuspension vor und zählen dann die Zellen. Zentrifugen Sie nun die Zellen bei 250 g für drei Minuten bei Raumtemperatur. Gießen Sie den Überstand aus und resuspendieren Sie das Zellpellet in Kryokonservierungsmedium.

Übertragen Sie als Nächstes einen Milliliter der Zellsuspension in ein 1,2-Milliliter-Kryofläschchen. Legen Sie die Kryo-Fläschchen in einen Gefrierbehälter und frieren Sie sie über Nacht bei minus 80 Grad Celsius ein. Füllen Sie die Fläschchen zur Langzeitlagerung in flüssigen Stickstoff um.

Um die gefrorenen Fläschchen aufzutauen, erhitzen Sie zunächst das Kulturmedium in Metallkügelchen, die auf 37 Grad Celsius erhitzt werden, und füllen Sie 10 Milliliter des erwärmten Kulturmediums in ein 15-Milliliter-Röhrchen vor. Entfernen Sie nun die kryogenen Fläschchen aus dem flüssigen Stickstoff und legen Sie sie für ein schnelles Auftauen in ein automatisches Auftausystem. Geben Sie 0,5 bis 1 Milliliter des vorgewärmten Kulturmediums in das kryogene Fläschchen, um eine allmähliche Zellanpassung zu gewährleisten.

Pipettieren Sie dann 1,5 bis zwei Milliliter der Zellsuspension in das 15-Milliliter-Röhrchen mit Medium. Zentrifugieren Sie die Zellen bei 250 g drei Minuten lang bei Raumtemperatur. Entsorgen Sie dann den Überstand.

Suspendieren Sie das Pellet in zwei Millilitern warmem Medium. Laden Sie die Zellen in ein Hämozytometer und zählen Sie sie, um die Genesungs- und Überlebensraten zu bestimmen. Kultivieren Sie die aufgetauten Zellen auf Basalmembran-beschichteten Platten in einem Kulturmedium mit Y27632.

Die retinalen Pigmentepithelzellen, die am fünften Tag in ihrer exponentiellen Phase eingefroren wurden, zeigten nach dem Auftauen eine höhere Attachmentrate. Bezogen auf ihre charakteristische hexagonale Morphologie wiesen die zu anderen Zeitpunkten eingefrorenen Zellen einen fibroblastischen Phänotyp auf. P2-Zellen am fünften Tag zeigten 28 Tage nach dem Auftauen eine höhere Expression und besser lokalisierte Zellmarker.

Es wurde festgestellt, dass verschiedene Kryokonservierungsmedien nach dem Auftauen eine hohe Zellviabilität und -bindung gleichermaßen gut erreichten.

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