Diese Arbeit wurde von der National Natural Science Foundation of China (81970816) an Mei Jiang finanziert; die National Natural Science Foundation of China (82201223) an Xinyue Zhu; und der Aktionsplan für wissenschaftliche und technologische Innovation der Shanghaier Wissenschafts- und Technologiekommission (2014090067000) an Haiyun Liu.

1. Dissoziation der Zellen
<ol><li>Pflegen Sie die RPE-Zellen wie zuvor beschrieben17,22. HINWEIS: Alle Zellen werden während der gesamten Dauer der Protokolle bei 37 °C in einer 5 % CO2 -Atmosphäre gezüchtet.</li>
	<li>Bereiten Sie die erforderliche Menge PBS und Kulturmedium in einem 37 ° C warmen Wasserbad vor und stellen Sie das Zelldissoziationsreagenz auf Raumtemperatur.</li>
	<li>Entsorgen Sie die Kulturlösung und waschen Sie die Platten zweimal mit 1 ml vorgewärmtem PBS pro Vertiefung.</li>
	<li>Geben Sie 1 ml des Zelldissoziationsreagenzes in die 6-Well-Platten und verdauen Sie die Zellen 15 Minuten lang bei 37 °C. Beobachten Sie nach der Inkubation die Zellen, die schrumpfen und an den Rändern glänzen, unter einem Mikroskop, um die Beendigung der Verdauung zu bestätigen. HINWEIS: Eine Dissoziation auf Trypsinbasis wird nicht empfohlen, da sie eine geringe Zellviabilität aufweist.</li>
	<li>Pipettieren Sie vorsichtig 10x mit einer 1-ml-Pipette auf und ab, um die Zellen zu dissoziieren, und verdünnen Sie die Zellsuspension mit vorgewärmtem Kulturmedium (ohne Y-27632) im Verhältnis 1:10. Dann zentrifugieren Sie die Zellen bei Raumtemperatur für 3 min bei 250 × g.</li>
	<li>Gießen Sie den Überstand nach der Zentrifugation schnell aus, resuspendieren Sie das Zellpellet vorsichtig in 2 mL des Kulturmediums und resuspendieren Sie die Zellen 10-15x mit einer Pipette.</li>
	<li>Filtern Sie die Zellsuspension mit einem 40 μm Zellsieb, um eine Einzelzellsuspension zu erhalten, und berechnen Sie die Anzahl der Zellen. HINWEIS: Eine einzelzellige Suspension ist für eine genaue Zellzählung und eine gleichmäßige Zellaussaatdichte nach dem Auftauen unerlässlich.</li>
</ol>2. Bestimmung des optimalen Zellstadiums für die Kryokonservierung
HINWEIS: Da der Zellzustand zwischen Differenzierungsmethoden und Zelllinien variiert, sollte die exponentielle Phase von RPE-Zellen, die in verschiedenen Labors kultiviert wurden, vor dem Einfrieren bestimmt werden.
<ol><li>Tauen Sie ein Fläschchen mit Basalmembran-Matrix-Lösung über Nacht bei 4 °C auf Eis auf. Die Matrix in 12 mL kaltes DMEM/F-12 verdünnen und gut mischen. Fügen Sie ein Deckglas pro Vertiefung hinzu und beschichten Sie jede Vertiefung einer 24-Well-Platte mit 0,25 ml der verdünnten Lösung. Die Platte vor Gebrauch 1 h bei Raumtemperatur oder über Nacht bei 4 °C inkubieren und die Beschichtungslösung kurz vor dem Plattieren der Zellen absaugen. HINWEIS: Die Anweisungen für das aliquote Volumen sind chargenspezifisch basierend auf der Proteinkonzentration und finden Sie im Produktdatenblatt.</li>
	<li>Die RPE-Einzelzellen aus Schritt 1.7 werden auf die mit Basalmembranmatrix beschichteten Deckgläser mit einer Dichte von 105/cm2 in 1 mL Kulturmedium ausgeimpft. Frischen Sie das Nährmedium alle 2-3 Tage auf.</li>
	<li>Zu den angegebenen Zeitpunkten (1, 3, 5, 7 und 11 Tage nach der Passage) inkubieren Sie RPE-Zellen mit 10 μM EdU im Medium für 24 Stunden. Fixieren, permeabilisieren und färben Sie die Zellen mit dem Reaktionscocktail, wie im Handbuch zum Nachweis von eingebautem EdU beschrieben.</li>
	<li>Nehmen Sie Bilder von fünf zufälligen Feldern unter einem Fluoreszenzmikroskop auf und berechnen Sie den Prozentsatz der EdU-positiven Zellen. Zeichnen Sie die entsprechenden EdU-positiven Verhältnis-Zeit-Kurven, um eine Wachstumskurve zu erstellen. Bestimmen Sie dann das Gefrierfenster oder die Exponentialphase für jede Zelllinie gemäß der Wachstumskurve. HINWEIS: Die wiederhergestellte hexagonale Zellmorphologie deutet darauf hin, dass die Zellen die exponentielle Phase verlassen.</li>
</ol>3. Kryokonservierung
<ol><li>Nach den Schritten 1.1 bis 1.7 wird die Zellsuspension bei Raumtemperatur 3 Minuten lang bei 250 × g zentrifugiert, mit der Ausnahme, dass sich die Aufschlusszeit auf 5 Minuten verringert.</li>
	<li>Entsorgen Sie den Überstand durch schnelles Eingießen nach der Zentrifugation und resuspendieren Sie das Zellpellet vorsichtig im Kryokonservierungsmedium auf eine Dichte von 2 × 106 Zellen/ml und überführen Sie 1 ml der Zellsuspension in 1,2 mL Kryofläschchen.</li>
	<li>Stellen Sie die kryogenen Fläschchen sofort in einen Gefrierbehälter, frieren Sie sie über Nacht bei -80 °C ein, um eine Abkühlrate von -1 °C/min zu erreichen, und überführen Sie die Fläschchen dann zur Langzeitlagerung in flüssigen Stickstoff.</li>
</ol>4. Auftauen
<ol><li>Erwärmen Sie das Kulturmedium in einem 37 °C warmen Wasserbad und füllen Sie 10 mL vorgewärmtes Kulturmedium in ein 15 mL Röhrchen vor.</li>
	<li>Tauen Sie die kryogenen Fläschchen, die direkt aus dem Flüssigstickstofflager entnommen werden, mit einem automatischen Auftausystem schnell auf.</li>
	<li>Tropfen Sie 0,5-1 ml vorgewärmtes Kulturmedium in das kryogene Fläschchen, um sicherzustellen, dass sich die gefrorenen Zellen allmählich an die neue Umgebung anpassen. Übertragen Sie dann 1,5-2 mL der Zellsuspension auf 10 mL des Kulturmediums in ein 15-ml-Röhrchen und zentrifugieren Sie die Zellen bei 250 × g für 3 Minuten bei Raumtemperatur.</li>
	<li>Verwerfen Sie den Überstand durch schnelles Eingießen nach der Zentrifugation, resuspendieren Sie das Pellet in 2 ml vorgewärmtem Kulturmedium und zählen Sie die Anzahl der Zellen mit einem Hämozytometer, um die Wiederfindungs- und Überlebensraten unter Verwendung des Standard-Trypanblau-Ausschlusses (0,4 % Trypanblau-Fleck) zu bestimmen.</li>
	<li>Die Zellen werden auf mit Basalmembranmatrix beschichteten Oberflächen mit einer Dichte von 105 lebensfähigen Zellen/cm2 in einem mit Y-27632 (Endkonzentration: 10 μM) angereicherten Kulturmedium kultiviert. Entfernen Sie Y-27632 nach 24 h.</li>
	<li>Um die Anheftungsrate zu bestimmen, dissoziieren Sie die Zellen erneut und zählen Sie die Anzahl der Zellen 24 h nach dem Auftauen.</li>
</ol>5. Validierung der optimalen Gefrierphase
<ol><li>Um die in Schritt 2.4 ermittelte optimale Gefrierphase zu validieren, tauen Sie RPE-Zellen, die zu verschiedenen Zeitpunkten eingefroren wurden, auf und kulturieren Sie sie 28 Tage lang. Ernte der Zellen für qPCR- und Immunfärbeanalysen, um die Expression von RPE-Markern wie zuvor beschrieben zu bewerten17.</li>
</ol>

Weiterentwicklung der Kryolagerung von aus menschlichen Stammzellen gewonnenen retinalen Pigment-Epithelzellen

<ol>
	<li>Lakkaraju, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+cell+biology+of+the+retinal+pigment+epithelium.">The cell biology of the retinal pigment epithelium.</a> Progress in Retinal and Eye Research. 78, 100846 (2020).</li><li>Mcbain, V. A., Townend, J., Lois, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Progression+of+retinal+pigment+epithelial+atrophy+in+stargardt+disease.">Progression of retinal pigment epithelial atrophy in stargardt disease.</a> American Journal of Ophthamology. 154 (1), 146-154 (2012).</li><li>George, S. M., Lu, F., Rao, M., Leach, L. L., Gross, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+retinal+pigment+epithelium:+Development,+injury+responses,+and+regenerative+potential+in+mammalian+and+non-mammalian+systems.">The retinal pigment epithelium: Development, injury responses, and regenerative potential in mammalian and non-mammalian systems.</a> Progress in Retinal and Eye Research. 85, 100969 (2021).</li><li>Rizzolo, L. J., Nasonkin, I. O., Adelman, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retinal+cell+transplantation,+biomaterials,+and+in+vitro+models+for+developing+next-generation+therapies+of+age-related+macular+degeneration.">Retinal cell transplantation, biomaterials, and in vitro models for developing next-generation therapies of age-related macular degeneration.</a> Stem Cells Translational Medicine. 11 (3), 269-281 (2022).</li><li>Bertolotti, E., Neri, A., Camparini, M., Macaluso, C., Marigo, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stem+cells+as+source+for+retinal+pigment+epithelium+transplantation.">Stem cells as source for retinal pigment epithelium transplantation.</a> Progress in Retinal and Eye Research. 42, 130-144 (2014).</li><li>Da Cruz, ., L, , et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phase+1+clinical+study+of+an+embryonic+stem+cell-derived+retinal+pigment+epithelium+patch+in+age-related+macular+degeneration.">Phase 1 clinical study of an embryonic stem cell-derived retinal pigment epithelium patch in age-related macular degeneration.</a> Nature Biotechnology. 36 (4), 328-337 (2018).</li><li>Mehat, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transplantation+of+human+embryonic+stem+cell-derived+retinal+pigment+epithelial+cells+in+macular+degeneration.">Transplantation of human embryonic stem cell-derived retinal pigment epithelial cells in macular degeneration.</a> Ophthalmology. 125 (11), 1765-1775 (2018).</li><li>Buchholz, D. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+and+efficient+directed+differentiation+of+human+pluripotent+stem+cells+into+retinal+pigmented+epithelium.">Rapid and efficient directed differentiation of human pluripotent stem cells into retinal pigmented epithelium.</a> Stem Cells Translational Medicine. 2 (5), 384-393 (2013).</li><li>Li, Q. -. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+assessment+of+cryopreserved+clinical+grade+hESC-RPE+cells+as+a+qualified+cell+source+for+stem+cell+therapy+of+retinal+degenerative+diseases.">Functional assessment of cryopreserved clinical grade hESC-RPE cells as a qualified cell source for stem cell therapy of retinal degenerative diseases.</a> Experimental Eye Research. 202, 108305 (2021).</li><li>Francois, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cryopreserved+mesenchymal+stromal+cells+display+impaired+immunosuppressive+properties+as+a+result+of+heat-shock+response+and+impaired+interferon-gamma+licensing.">Cryopreserved mesenchymal stromal cells display impaired immunosuppressive properties as a result of heat-shock response and impaired interferon-gamma licensing.</a> Cytotherapy. 14 (2), 147-152 (2012).</li><li>Moll, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Do+cryopreserved+mesenchymal+stromal+cells+display+impaired+immunomodulatory+and+therapeutic+properties.">Do cryopreserved mesenchymal stromal cells display impaired immunomodulatory and therapeutic properties.</a> Stem Cells. 32 (9), 2430-2442 (2014).</li><li>Ekpo, M. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Incorporating+cryopreservation+evaluations+into+the+design+of+cell-based+drug+delivery+systems:+an+opinion+paper.">Incorporating cryopreservation evaluations into the design of cell-based drug delivery systems: an opinion paper.</a> Frontiers in Immunology. 13, 967731 (2022).</li><li>Bailey, T. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protective+effects+of+osmolytes+in+cryopreserving+adherent+neuroblastoma+(Neuro-2a)+cells.">Protective effects of osmolytes in cryopreserving adherent neuroblastoma (Neuro-2a) cells.</a> Cryobiology. 71 (3), 472-480 (2015).</li><li>Okumura, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Feasibility+of+a+cryopreservation+of+cultured+human+corneal+endothelial+cells.">Feasibility of a cryopreservation of cultured human corneal endothelial cells.</a> PLoS One. 14 (6), e0218431 (2019).</li><li>Pennington, B. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Xeno-free+cryopreservation+of+adherent+retinal+pigmented+epithelium+yields+viable+and+functional+cells+in+vitro+and+in+vivo.">Xeno-free cryopreservation of adherent retinal pigmented epithelium yields viable and functional cells in vitro and in vivo.</a> Scientific Reports. 11 (1), 6286 (2021).</li><li>Woods, E. J., Thirumala, S., Badhe-Buchanan, S. S., Clarke, D., Mathew, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Off+the+shelf+cellular+therapeutics:+Factors+to+consider+during+cryopreservation+and+storage+of+human+cells+for+clinical+use.">Off the shelf cellular therapeutics: Factors to consider during cryopreservation and storage of human cells for clinical use.</a> Cytotherapy. 18 (6), 697-711 (2016).</li><li>Zhang, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determining+the+optimal+stage+for+cryopreservation+of+human+embryonic+stem+cell-derived+retinal+pigment+epithelial+cells.">Determining the optimal stage for cryopreservation of human embryonic stem cell-derived retinal pigment epithelial cells.</a> Stem Cell Research &amp; Therapy. 13 (1), 454 (2022).</li><li>Leach, L. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induced+pluripotent+stem+cell-derived+retinal+pigmented+epithelium:+a+comparative+study+between+cell+lines+and+differentiation+Methods.">Induced pluripotent stem cell-derived retinal pigmented epithelium: a comparative study between cell lines and differentiation Methods.</a> Journal of Ocular Pharmacology and Therapeutics. 32 (5), 317-330 (2016).</li><li>Reichman, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+storable+retinal+organoids+and+retinal+pigmented+epithelium+from+adherent+human+iPS+cells+in+Xeno-free+and+feeder-free+conditions.">Generation of storable retinal organoids and retinal pigmented epithelium from adherent human iPS cells in Xeno-free and feeder-free conditions.</a> Stem Cells. 35 (5), 1176-1188 (2017).</li><li>Brandl, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In-depth+characterisation+of+retinal+pigment+epithelium+(RPE)+cells+derived+from+human+induced+pluripotent+stem+cells+(hiPSC).">In-depth characterisation of retinal pigment epithelium (RPE) cells derived from human induced pluripotent stem cells (hiPSC).</a> Neuromolecular Medicine. 16 (3), 551-564 (2014).</li><li>Hongisto, H., Ilmarinen, T., Vattulainen, M., Mikhailova, A., Skottman, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Xeno-+and+feeder-free+differentiation+of+human+pluripotent+stem+cells+to+two+distinct+ocular+epithelial+cell+types+using+simple+modifications+of+one+method.">Xeno- and feeder-free differentiation of human pluripotent stem cells to two distinct ocular epithelial cell types using simple modifications of one method.</a> Stem Cell Research &amp; Therapy. 8 (1), 291 (2017).</li><li>Foltz, L. P., Clegg, D. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid,+directed+differentiation+of+retinal+pigment+epithelial+cells+from+human+embryonic+or+induced+pluripotent+stem+cells.">Rapid, directed differentiation of retinal pigment epithelial cells from human embryonic or induced pluripotent stem cells.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (128), 10.3791/56274 (2017).</li><li>Marcantonini, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Natural+cryoprotective+and+cytoprotective+agents+in+cryopreservation:+a+focus+on+melatonin.">Natural cryoprotective and cytoprotective agents in cryopreservation: a focus on melatonin.</a> Molecules. 27 (10), 3254 (2022).</li></ol>

Die Autoren haben keine Interessenkonflikte offenzulegen.

In der vorliegenden Studie wird ein erfolgreiches Freeze-Tau-Protokoll für hESC-abgeleitete RPE-Zellen für Forschung und klinische Zwecke beschrieben. Im Gegensatz zur immortalisierten RPE-Zelllinie ARPE-19 sind RPE-Zellen mit dem richtigen charakteristischen epithelialen Phänotyp und der richtigen Funktion, wie z. B. aus Stammzellen gewonnene RPE-Zellen, empfindlicher gegenüber der Kryokonservierung. Weniger als 32 % der Zellen blieben 24 Stunden nach dem Auftauen erhalten, wenn sie nicht richtig konserviert<sup cla...

Das retinale Pigmentepithel (RPE) ist eine pigmentierte Monoschicht von Zellen, die für die Aufrechterhaltung der ordnungsgemäßen Funktion der Netzhaut erforderlich ist1. RPE-Dysfunktion und Tod sind eng mit vielen degenerativen Erkrankungen der Netzhaut verbunden, darunter altersbedingte Makuladegeneration, Retinitis pigmentosa und Morbus Stargardt 2,3. Die RPE-Ersatztherapie ist eines der vielversprechendsten Behandlungsschemata für diese Erkrankungen 4,5,6,7. Eine stabile Versorgung mit RPE-Spenderzellen ist für die Zelltherapie unerlässlich. Aus humanen embryonalen Stammzellen (hESC) gewonnene RPE-Zellen sind eine ideale Zellquelle für die Zelltherapie, da sie die Funktion primärer RPE-Zellen nachahmen und einen theoretisch unbegrenzten Vorrat produzieren können8. Der Differenzierungsprozess ist jedoch mühsam und die Haltbarkeit der gewonnenen RPE-Zellen ist aufgrund der anschließenden epithelial-mesenchymalen Transition (EMT) relativ kurz. Daher ist die Kryokonservierung von hESC-abgeleiteten RPE-Zellen ein unverzichtbarer Schritt, der für die Langzeitlagerung und die bedarfsgerechte Verteilung erforderlichist 9.
Durch Kryokonservierung induzierte zelluläre Schäden können die therapeutische Wirksamkeit ungewollt beeinträchtigen 10,11. Neuere Studien zur Kryokonservierung haben daher vorgeschlagen, dass bei der Entwicklung von Zelltherapien optimale kryogene Lagerbedingungen bestimmt werden sollten12. Eine erfolgreiche Kryokonservierung garantiert eine effiziente Zellrückgewinnung, eine hohe Lebensfähigkeit und die Wiederherstellung der Zellfunktion nach dem Frost-Auftau-Zyklus. Frühere Studien zur Kryokonservierung der adhärenten Monoschichten von Säugetierzellen haben jedoch sehr unterschiedliche (35%-95%) Überlebensraten nach dem Auftauen berichtet 13,14,15. Viele Faktoren beeinflussen die Ergebnisse der Kryokonservierung erheblich, insbesondere während der Gefrierphase16,17. Neuere Forschungen zeigten, dass RPE-Zellen, die zu verschiedenen Zeitpunkten eingefroren wurden, nach dem Auftauen eine unterschiedliche Erholungzeigten 17. Nach bestem Wissen und Gewissen fehlen Studien zur Bestimmung des optimalen Gefrierzeitfensters für stammzellgewonnene RPE-Zellen. In verschiedenen Studien wurden die Zellen in verschiedenen Stadien eingefroren: Einige Zellen wurden kurz nach der Passage oder vor der Konfluenz oder Pigmentierungeingefroren 8,15,18, während andere zu anderen Zeitpunkteneingefroren wurden 9,19,20,21. Darüber hinaus gibt es keine eindeutigen Hinweise darauf, ob die Phase oder das Stadium von RPE-Zellen, die für die Kryokonservierung verwendet werden, die RPE-Funktion nach dem Auftauen beeinflusst. In unserer vorherigen Studie haben wir zum ersten Mal gezeigt, dass die exponentielle Phase des Zellwachstums (P2D5) das beste Stadium für die Kryokonservierung von hESC-abgeleiteten RPE-Zellen im Hinblick auf die Zellviabilität und die Wiederherstellung zellulärer Eigenschaften und Funktionen ist17.
Die hier etablierte Methode zielt darauf ab, hESC-abgeleitetes RPE in einem optimalen Stadium zu kryokonservieren, um die beste Konservierung in Bezug auf die Lebensfähigkeit und Funktion der Zellen nach dem Auftauen zu erreichen. Unter Verwendung des 5-Ethinyl-2'-Desoxyuridins (EdU)-Markierungsassays zum Nachweis der exponentiellen Phase der DNA-Synthese vor der Kryokonservierung zeigten aufgetaute RPE-Zellen eine >80%ige Lebensfähigkeit und Anheftungsrate, eine RPE-spezifische Genexpression, eine polarisierte Zellmorphologie, eine Sekretion von Pigmentepithelfaktoren, eine angemessene transepitheliale Resistenz und phagozytische Fähigkeit 8,17,22. Obwohl sich dieses Protokoll auf hESC-abgeleitete RPE-Zellen konzentriert und nicht alle therapeutischen Zellen gleichermaßen kryokonserviert sind, kann die Strategie des Einfrierens in der exponentiellen Phase auf viele andere therapeutische Zellen angewendet werden.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>40 &#956;m Cell strainer</td>
			<td>Corning</td>
			<td>431750</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Click-iT EdU Cell Proliferation Kit for Imaging, Alexa Fluor 488 Dye</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>C10337</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryo freezing container</td>
			<td>Nalgene</td>
			<td>5100-0001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CryoStor CS10</td>
			<td>Biolife Solutions</td>
			<td>07930</td>
			<td>cryopreservation medium #1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS, no calcium, no magnesium</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>14190144</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Genxin</td>
			<td>Selcell</td>
			<td>YB050050</td>
			<td>cryopreservation medium #2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human embryonic stem cells</td>
			<td>provided by Wicell, USA</td>
			<td>H9 cell line</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrigel, hESC-Qualified Matrix</td>
			<td>Corning</td>
			<td>354277</td>
			<td>basement membrane matrix</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ThawSTAR CFT2 Automated Cell Thawing System</td>
			<td>BioLife Solutions</td>
			<td>AST-601</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan Blue solution 0.4%</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T8154</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TryPLE Select</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>12563029</td>
			<td>cell dissociation reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XVIVO-10 medium</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>BEBP04-743Q</td>
			<td>RPE culture medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Y-27632</td>
			<td>Selleck</td>
			<td>S1049</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

cryopreservation of human embryonic stem cell-derived retinal pigment epithelial cells at the optimal stage

Retinale Pigmentepithelzellen (RPE), die aus humanen embryonalen Stammzellen (hESCs) gewonnen werden, sind überlegene Zellquellen für die Zellersatztherapie bei Personen mit degenerativen Netzhauterkrankungen. Studien über die stabile und sichere Lagerung dieser therapeutischen Zellen gibt es jedoch kaum. Die hochvariable Zellviabilität und die funktionelle Wiederherstellung von RPE-Zellen nach der Kryokonservierung sind die am häufigsten auftretenden Probleme. Im vorliegenden Protokoll haben wir versucht, die beste Zellwiederherstellungsrate nach dem Auftauen zu erreichen, indem wir die optimale Zellphase für das Einfrieren auf der Grundlage der ursprünglichen experimentellen Bedingungen ausgewählt haben. Die Zellen wurden in der exponentiellen Phase eingefroren, die mit dem 5-Ethinyl-2′-Desoxyuridin-Markierungsassay bestimmt wurde, was die Lebensfähigkeit der Zellen und die Wiederfindungsrate nach dem Auftauen verbesserte. Kurz nach dem Auftauen wurden stabile und funktionsfähige Zellen erhalten, unabhängig von einem langen Differenzierungsprozess. Die hier beschriebenen Methoden ermöglichen die einfache, effiziente und kostengünstige Konservierung und das Auftauen von hESC-abgeleiteten RPE-Zellen. Obwohl sich dieses Protokoll auf RPE-Zellen konzentriert, kann diese Einfrierstrategie auf viele andere Arten von differenzierten Zellen angewendet werden.

The retinal pigment epithelium (RPE) is a pigmented monolayer of cells required for maintaining the proper function of the retina1. RPE dysfunction and death are closely associated with many retinal degenerative diseases, including age-related macular degeneration, retinitis pigmentosa, and Stargardt disease2,3. RPE replacement therapy is one of the most promising treatment regimens for these diseases4,5,6,7. A stable supply of donor RPE cells is vital for cell therapy. Human embryonic stem cell (hESC)-derived RPE cells are an ideal cell source for cell therapy because they mimic the function of primary RPE cells and can produce a theoretically unlimited supply8. However, the differentiation process is laborious and the shelf-life of the obtained RPE cells is relatively short because of subsequent epithelial-mesenchymal transition (EMT). Therefore, the cryopreservation of hESC-derived RPE cells is an indispensable step required for long-term storage and on-demand distribution9.
Cryopreservation-induced cellular damage can inadvertently compromise therapeutic efficacy10,11. Therefore, recent studies on cryopreservation have proposed that optimal cryogenic storage conditions should be determined when designing cell therapies12. Successful cryopreservation guarantees efficient cell recovery, high viability, and cell function restoration after the freeze-thaw cycle. However, previous studies on the cryopreservation of the adherent monolayers of mammalian cells have reported highly variable (35%-95%) survival rates after thawing13,14,15. Many factors considerably affect the outcomes of cryopreservation, particularly during the freezing stage16,17. Recent research showed that RPE cells frozen at different time points exhibited varied recovery after thawing17. To the best of our knowledge, studies on the determination of the optimal freezing time window for stem cell-derived RPE cells are lacking. In different studies, the cells were frozen at various stages: some cells were frozen shortly after passaging or before confluency or pigmentation8,15,18, whereas others were frozen at other time points9,19,20,21. Furthermore, there is no clear evidence of whether the phase or stage of RPE cells used for cryopreservation affects RPE function after thawing. In our previous study, we demonstrated for the first time that the exponential phase of cell growth (P2D5) is the best stage for the cryopreservation of hESC-derived RPE cells in terms of cell viability and the recovery of cellular properties and functions17.
The method established here aims to cryopreserve hESC-derived RPE at an optimal stage to achieve the best preservation in terms of cell viability and function after thawing. Using the 5-ethynyl-2&#39;-deoxyuridine (EdU) labeling assay to detect the exponential phase of DNA synthesis before cryopreservation, thawed RPE cells exhibited &#62;80% viability and attachment rate, RPE-specific gene expression, polarized cell morphology, pigment epithelium-derived factor secretion, appropriate transepithelial resistance, and phagocytic ability8,17,22. Although this protocol focuses&#160;on hESC-derived RPE cells and not all therapeutic cells are equally cryopreserved, the strategy of freezing in the exponential phase may be applied to many other therapeutic cells.

Autoren-Spotlight: Entwicklung einer effizienten und praktikablen Methode zum Einfrieren von retinalen Pigment-Epithelzellen

Kryokonservierung von aus humanen embryonalen Stammzellen gewonnenen retinalen Pigmentepithelzellen im optimalen Stadium

Our lab aims to better understand the molecular mechanism of retinal diseases, with a focus on unmet medical needs of patients. We aim to develop effective treatments, such as stem-cell-based therapies, for them. Cryopreservation of stem-cell-derived RPE cells is an important step for RPE replacement therapy.Currently, the cells are frozen at various stages, resulting in highly variable survival rates for thawing. This is needed to determine the optimal cell stage for freezing these cells. Our protocol provides a simple, efficient, and inexpensive ways of freezing RPE cells by determining the exponential phase of RPE cells for freezing.It's less dependent of differentiated methods or cell lines.

Hier wurden hESC-abgeleitete RPE-Zellen an P1D35 mit einer Dichte von 105/cm2 passageiert und ausgesiedelt. Innerhalb einer Woche nach der Aussaat gingen die charakteristische hexagonale Morphologie und Pigmentierung während der Verzögerungsphase (ca. 2 Tage) verloren. RPE-Zellen nahmen in der exponentiellen Phase (ca. 5 Tage, Abbildung 1A) allmählich die hexagonale Morphologie wieder an und traten mit einer polygonaleren Morphologie in die Verlangsamungsphase (ca. 6...

Watch this Scientific Journal Video about Cryopreservation of Human Embryonic Stem Cell-Derived Retinal Pigment Epithelial Cells at the Optimal Stage at JoVE.com

Diese Studie liefert ein detailliertes Protokoll für die effiziente Kryokonservierung von aus menschlichen Stammzellen gewonnenen retinalen Pigmentepithelzellen.

Retinal pigment epithelial&#160;(RPE) cells derived from human embryonic stem cells (hESCs) are superior cell sources for cell replacement therapy in ...

Unser Labor zielt darauf ab, den molekularen Mechanismus von Netzhauterkrankungen besser zu verstehen, wobei der Schwerpunkt auf ungedeckten medizinischen Bedürfnissen von Patienten liegt. Unser Ziel ist es, für sie wirksame Therapien, wie z. B. stammzellbasierte Therapien, zu entwickeln. Die Kryokonservierung von aus Stammzellen gewonnenen RPE-Zellen ist ein wichtiger Schritt für die RPE-Ersatztherapie.Derzeit werden die Zellen in verschiedenen Stadien eingefroren, was zu sehr unterschiedlichen Überlebensraten beim Auftauen führt. Dies wird benötigt, um das optimale Zellstadium für das Einfrieren dieser Zellen zu bestimmen. Unser Protokoll bietet eine einfache, effiziente und kostengünstige Möglichkeit zum Einfrieren von RPE-Zellen, indem es die exponentielle Phase von RPE-Zellen zum Einfrieren bestimmt.Es ist weniger abhängig von differenzierten Methoden oder Zelllinien.

cryopreservation-human-embryonic-stem-cell-derived-retinal-pigment

Research

JoVE Journal

Medicine

Cryopreservation of Human Embryonic Stem Cell-Derived Retinal Pigment Epithelial Cells at the Optimal Stage

476 Aufrufe.  Shanghai Jiao Tong University School of Medicine. Unser Labor zielt darauf ab, den molekularen Mechanismus von Netzhauterkrankungen besser zu verstehen, wobei der Schwerpunkt auf ungedeckten medizinischen Bedürfnissen von Patienten liegt. Unser Ziel ist es, für sie wirksame Therapien, wie z. B. stammzellbasierte Therapien, zu entwickeln. Die Kryokonservierung von aus Stammzellen gewonnenen RPE-Zellen ist ein wichtiger Schritt für die RPE-Ersatztherapie.Derzeit werden die Zellen in verschiedenen Stadien eingefroren, was zu sehr unte...

Serie: Autoren-Spotlight: Entwicklung einer effizienten und praktikablen Methode zum Einfrieren von retinalen Pigment-Epithelzellen

Retinal pigment epithelial&#160;(RPE) cells derived from human embryonic stem cells (hESCs) are superior cell sources for cell replacement therapy in individuals with retinal degenerative diseases; however, studies on the stable and secure banking of these therapeutic cells are scarce. Highly variable cell viability and functional recovery of&#160;RPE cells after cryopreservation are the most commonly encountered issues. In the present protocol, we aimed to achieve the best cell recovery rate after thawing by selecting the optimal cell phase for freezing based on the original experimental conditions. Cells were frozen in the exponential phase determined by using the 5-ethynyl-2&#8242;-deoxyuridine labeling assay, which improved cell viability and recovery rate after thawing. Stable and functional cells were obtained shortly after thawing, independent of a long differentiation process. The methods described here allow the simple, efficient, and inexpensive preservation and thawing of hESC-derived RPE cells. Although this protocol focuses on RPE cells, this freezing strategy may be applied to many other types of differentiated cells.

This study provides a detailed protocol for the efficient cryopreservation of human stem cell-derived retinal pigment epithelial cells.

Forschung

Medizin

Human Embryonic Stem Cell-Derived Retinal Pigment Epithelial Cell Dissociation and Optimal Cryopreservation Stage Determination

To begin, dilute a vial of thawed cold basement membrane matrix with 12 milliliters of DM EM F12. Mix the suspension well. Add one cover slip into each well of a 24-well plate.Then, pipette 250 microliters of the dilute matrix solution into each well. Discard the culture medium of the cultured hESC derived retinal pigment epithelial cell plates. Wash the plates two times with one milliliter of preheated PBS per well.Next, add 0.5 milliliters of the cell dissociation reagent to the wells of the culture plates, and incubate them at 37 degrees Celsius for 15 minutes to initiate digestion. After incubation, observe the cells under the microscope to confirm the end of digestion. Now with a one milliliter pipette, gently pipette the cell suspension up and down 10 times.Add preheated culture medium to dilute the suspension. Then, centrifuge it at 250 G for three minutes at room temperature. Pour out the supernatant from the centrifuge tube.Then, re-suspend the cell pellet in two milliliters of the culture medium. Use a pipette to mix the cells 10 to 15 times. Filter the cell suspension through a 40 micrometer cell strainer.Next, count the retinal pigment epithelial cells. Aspirate the coating solution before plating. Then, add one milliliter of the culture medium into each well and seed the cells on the cover slips.After EDU incorporation and staining, capture the images of five random fields with a fluorescence microscope. Calculate the percentage of EDU positive cells. Then, plot the corresponding proportion time curves to generate a growth curve.Lastly, determine the freezing window from the exponential phase for each cell line. The retinal pigment epithelial cells initially lost their characteristic hexagonal morphology, but later regained it in the exponential phase of growth. When the cells were cultured for an additional week, cell proliferation decreased.EDU proliferation assay confirmed that P2 day five cells exhibited a higher proliferation rate, whereas P2 day 11 cells had entered the deceleration phase.

Dissoziation von Epithelzellen aus humanen embryonalen Stammzellen aus embryonalen Stammzellen und Bestimmung des optimalen Kryokonservierungsstadiums

Preservation of Human Embryonic Stem Cell-Derived Retinal Pigment Epithelial Cells with Optimized Cryopreservation

To begin, dissociate the hESC-derived retinal pigment epithelial cells, prepare the cell suspension, and then count the cells. Now, centrifuge the cells at 250g for three minutes at room temperature. Pour out the supernatant, then, resuspend the cell pellet in cryopreservation medium.Next, transfer one milliliter of the cell suspension to a 1.2-milliliter cryogenic vial. Place the cryogenic vials in a freezing container and freeze overnight at minus 80 degrees Celsius. Transfer the vials to liquid nitrogen for long-term storage.To thaw the frozen vials, first heat the culture medium in metallic beads heated to 37 degrees Celsius, pre-fill 10 milliliters of the warmed culture medium into a 15-milliliter tube. Now, remove the cryogenic vials from the liquid nitrogen and place them in an automated thawing system for rapid thawing. Drop 0.5 to one milliliter of the preheated culture medium into the cryogenic vial to ensure gradual cell adaptation.Then, pipet 1.5 to two milliliters of the cell suspension to the 15-milliliter tube with medium. Centrifuge the cells at 250g for three minutes at room temperature. Then, discard the supernatant.Resuspend the pellet in two milliliters of warm medium. Load the cells in a hemocytometer and count them to determine the recovery and survival rates. Culture the thawed cells on basement membrane coated plates in a culture medium with Y27632.The retinal pigment epithelial cells that were frozen on day five in their exponential phase displayed a higher attachment rate after thawing. Relative to their characteristic hexagonal morphology, the cells frozen at other time points had a fibroblastic phenotype. P2 day-five cells displayed higher expression and more properly localized cell markers 28 days after thawing.It was noted that different cryopreservation media performed equally well in achieving high cell viability and attachment post-thawing.