Legen Sie zunächst Zellkultureinsätze in eine 24-Well-Gewebekultur-Adapterplatte. Die apikale Seite der Einsätze mit 100 Mikrolitern Basalmembran-extrazellulärer Matrix oder BME in enteroiden Wachstumsmedien vorbeschichten. Beschichten Sie einen zusätzlichen Einsatz zur Verwendung als Kontrolle bei Messungen der Barriereintegrität.
Anschließend wird der beschichtete Einsatz eine Stunde lang bei 37 Grad Celsius unter 5 % Kohlendioxid inkubiert. Sobald die Inkubation abgeschlossen ist, saugen Sie das 3D-enteroide Kulturmedium ab. Entnehmen Sie die bovinen ilealen Enteroide in 1 Milliliter eiskaltem Waschmedium.
Verwenden Sie einen Zellschaber, um die Kuppeln zu lösen und in einem konischen 15-Milliliter-Röhrchen zu sammeln. Mit einer 1-Milliliter-Pipettenspitze 30 Mal verreiben, um enteroide Fragmente zu erzeugen. Als nächstes verwenden Sie eine 200-Mikroliter-Pipettenspitze, um etwa 40 Mal weiter zu reiten, um die enteroiden Fragmente aufzubrechen.
Füllen Sie das Volumen der Tube mit eiskaltem Waschmedium auf 10 Milliliter auf. Dann zentrifugieren Sie das Röhrchen bei 300 g für fünf Minuten bei Raumtemperatur. Saugen Sie den Überstand, einschließlich der BME-Schicht, vorsichtig ab.
Als nächstes wird das Pellet für jeweils vier Kuppeln in 1 Milliliter vorgewärmtem TrypLE-Express-Enzym resuspendiert. Die Mischung auf eine 24-Well-Platte geben und bei 37 Grad Celsius unter 5 % Kohlendioxid 10 Minuten lang inkubieren. Pipettieren Sie die Mischung vorsichtig mit einer 1-Milliliter-Pipette, um die Enteroide weiter aufzuspalten.
Anschließend wird die Mischung mit einer 200-Mikroliter-Pipette pipettiert, um die Fragmente in einzelne Zellen zu zerlegen. Verwenden Sie eine 3-Milliliter-Spritze, die mit einer sterilen 22-Gauge-Nadel ausgestattet ist, um die Zellsuspension viermal abzusaugen und zu dosieren, um eine Einzelzellsuspension zu erhalten. Überwachen Sie mit einem Mikroskop die Zelldissoziation, bis 80 % der Enteroide in einzelne Zellen zerlegt sind.
Sammeln Sie nun die Zellsuspension in einem konischen 15-Milliliter-Röhrchen. Fügen Sie vier Volumina FBS-Waschmedium hinzu, um die Reaktion zu löschen. Anschließend filtrieren Sie die Enteroide durch ein vorbeschichtetes 40-Mikrometer-Zellsieb zweimal in ein konisches 50-Milliliter-Röhrchen.
Zentrifugieren Sie die Suspension fünf Minuten lang bei 300 g, um die Zellen zu pelletieren. Saugen Sie den Überstand in das Zentrifugenröhrchen mit dissoziierter boviner ilealer enteroider Zellsuspension ab. Resuspendieren Sie das Pellet in einem kleinen Volumen eines organoiden Wachstumsmediums.
Als nächstes verwenden Sie die Trypanblau-Farbstoffausschlussmethode und das Hämazytometer, um die Lebensfähigkeit der Zellen zu bestimmen. Überschüssige Beschichtungslösung vorsichtig aus dem Zellkultureinsatz entfernen. Säen Sie die 200 Mikroliter der Einzelzellsuspension auf die apikale Oberfläche eines vorbeschichteten Kultureinsatzes.
Geben Sie nun 700 Mikroliter FBS-Komplettmedien auf die basale laterale Seite des Einsatzes. Verschieben Sie die Platte etwa 10 Mal in Form der Zahl Acht, um die Zellen gleichmäßig über den Einsatz zu verteilen. Anschließend stellen Sie den Teller für 10 Minuten auf den Tellerwärmer in die Biosicherheitswerkbank.
Inkubieren Sie die Platte bei 37 Grad Celsius unter 5 % Kohlendioxid nach 48 Stunden. Ersetzen Sie nach der Inkubation das Medium auf den apikalen und basalen Komponenten durch frisches enteroides Wachstumsmedium. Entfernen Sie am nächsten Tag das Medium aus den apikalen und basalen lateralen Kompartimenten.
Waschen Sie den Einsatz vorsichtig mit PBS und ersetzen Sie ihn durch enteroide Differenzierungsmedien, die nur mit Inhibitoren ergänzt werden. Die Bildung der Enterosphäre wurde einige Stunden nach der Kultivierung der plattierten Rinderkrypten beobachtet. Nach zwei Tagen war das Lumen der Kugeln gut definiert, wobei am vierten Tag knospendende Strukturen beobachtet wurden.
Reife Enteroide wurden am siebten Tag beobachtet. Die Immunfärbung der sieben Tage alten 3D-Enteroide zeigte das Vorhandensein verschiedener Zelllinien. Das E-Cadherin-Protein wurde an der Adhärenzverbindung lokalisiert.
Die Enteroide waren positiv für enteroendokrine Zellen und Lysozym-produzierende Paneth-Zellen. Konfluente 2D-Monoschichten wurden in weniger als einer Woche Kultur beobachtet.
