Beschichten Sie zunächst eine Mikrowellenschale mit 150 Mikrolitern 0,01 % bis 0,1 % Zellanhaftungslösung, bevor Sie inkubieren. Sobald die Schale an der Luft getrocknet ist, geben Sie 80 Mikroliter Gold-Nanopartikel-Lösung tropfenweise auf die trockene Oberfläche. Entfernen Sie am nächsten Tag das hinzugefügte Nährmedium aus der Mikrovertiefung.
Geben Sie dann zwei Milliliter der transfizierten Zellen auf die immobilisierten Gold-Nanopartikel auf der Glasoberfläche. Inkubieren Sie die Platte vor Beginn des Experiments. Verwenden Sie ein konfokales Mikroskop mit einem Organlaser, der auf 488 Nanometer eingestellt ist, um die GFP-Fluoreszenz des Annexin-Proteins zu sehen.
Stellen Sie den Helium-Neonlaser auf 633 Nanometer ein, um die Reflexion der Gold-Nanopartikel zu beobachten. Wählen Sie einzelne Zellen anstelle von Zellclustern, um eine Überlappung der Plasmamembranen zu vermeiden. Stellen Sie sicher, dass die immobilisierten Gold-Nanopartikel als einzelne Partikel und in ausreichendem Abstand vorhanden sind, um einen erhöhten Temperaturgradienten zu vermeiden.
Bestrahlen Sie das Gold-Nanopartikel mit der optischen Pinzette eine Sekunde lang, um die Plasmamembran zu durchbrechen. Um riesige unilamellare Vesikel oder GUV zu erzeugen, tragen Sie 90 Mikroliter erwärmtes 5%iges PVA-Gel auf einen Objektträger auf. Verteilen Sie das Gel gleichmäßig auf dem Objektträger.
Anschließend den Objektträger in einem Wärmeschrank bei 50 Grad Celsius für 50 Minuten trocknen lassen. Tragen Sie anschließend mit einer Glasspritze 30 Mikroliter Lipidmischung auf. Mit dem Nadelrand die Masse zu einem dünnen Film verteilen.
Wenden Sie einen sanften Stickstoffgasstrom an, um das Chloroform der Lipidmischung zu verdampfen. Anschließend trocknen Sie die Objektträger 1,5 bis 2 Stunden unter Vakuum. In ein separates Zwei-Milliliter-Röhrchen 400 Mikroliter Wachstumspuffer geben.
Dann fügen Sie das rekombinante Protein von Interesse zu einer Endkonzentration von 500 Nanomolaren hinzu. Pipettieren Sie 400 Mikroliter des verdünnten Proteins in die eingebaute hauseigene Kammer und wickeln Sie die Kammer in PERIFIL ein. Nach einer einstündigen Inkubation werden 400 Mikroliter des Kammerinhalts in ein Zwei-Milliliter-Röhrchen überführt.
Geben Sie einen Milliliter Beobachtungspuffer in die gesammelte Lösung, um alle nicht verkapselten Proteine zu entfernen. Anschließend wird die Lösung bei 600 g für 10 Minuten bei 13 Grad Celsius zentrifugiert. Ersetzen Sie als Nächstes einen Milliliter des Überstandes durch einen Beobachtungspuffer und pipettieren Sie vorsichtig, um die GUVs zu dispergieren.
Bis zum Beginn des Experimentierens in den Kühlschrank stellen. Um das GUV zu durchstechen, bestreichen Sie zunächst die Oberfläche einer 35 Millimeter großen Glasbodenschale mit Beta-Kasein. Als nächstes fügen Sie 5 Mikroliter 150-Nanometer-Gold-Nanoschalen zu der GUV-Mischung hinzu, die Kalziumchlorid enthält.
Geben Sie die Mischung in die Kammer und montieren Sie sie auf dem Mikroskoptisch. Verwenden Sie die optische Pinzette, um eine einzelne Gold-Nano-Hülle an der GUV-Oberfläche einzufangen. Wenn die eingeschlossene Nanohülle in engem Kontakt mit der GUV-Membran steht, erhöhen Sie die Laserleistung, um die Zielstelle zu punktieren.
Die Bestrahlung mit Nanopartikeln führte zu einer Membranverletzung und verursachte eine schnelle Rekrutierung von Annexinen an der Verletzungsstelle, nachdem Kalziumeinstrom eine ringförmige Struktur gebildet hatte. In den GUV-Experimenten wurde die Membranpunktion in Abwesenheit von Annexinen schnell wieder verschlossen. Die einzigartigen biophysikalischen Eigenschaften des Annexin-A4-Proteins führten aufgrund seiner Fähigkeit, Membranen zu rollen, zum Platzen des GUV.
Das Vorhandensein von Annexin in GUVs verursachte nach einer Membranpunktion eine schnelle Akkumulation an der Verletzungsstelle. Die Analyse der Annexin-A5-Ringe in den Zellexperimenten zeigte, dass sie über Zeit und Raum konstant blieben. Der Aufschluss der Plasmamembran mittels Thermoplasmonik führte zu erhöhten Kalziumionenspiegeln.
Die Zellen erreichten eine maximale Kalziumintensität nach 6,6 Sekunden, ein Zeitpunkt, von dem angenommen wird, dass er dem Zeitpunkt des Wundverschlusses entspricht.
