Zu Beginn werden die sezierten Anopheles-Mückenköpfe in CCD-Puffer bei 37 Grad Celsius auf einem Hitzeblock fünf Minuten lang vorgeheizt. Das Röhrchen mit den Moskitoköpfen zur Rotation bei 37 Grad Celsius in einen Hybridisierungsofen geben. Als nächstes gibst du den gesamten Inhalt des Röhrchens in ein Sezieruhrglas um.
Nehmen Sie mit einer Pinzette die Köpfe oder abgetrennte Antennen auf und fixieren Sie sie in einem Milliliter des Präfixiermittels. In einem Nutator drehen Sie die Köpfe im Präfixiermittel für 24 Stunden bei vier Grad Celsius. Um eine Gewebedissektion durchzuführen, spülen Sie zunächst die Köpfe mit einem Milliliter 0,1%PBS-Tween auf Eis.
Setzen Sie dann die Köpfe in ein Sezieruhrglas um. Entferne unter einem Präpariermikroskop das interessierende Gewebe mit einer scharfen Pinzette aus dem Kopf. Halten Sie den vorderen Teil des Kopfes mit der Pinzette fest und greifen Sie mit einer anderen Zange eine Antenne von der Basis aus.
Entfernen Sie auf ähnliche Weise die Palpen. Übertragen Sie die Antennen und Palps in leere DNA/RNA-freie Röhrchen, die auf Eis gestellt werden. Dehydrieren Sie das Gewebe in 400 Mikrolitern Entwässerungsreagenz für eine Stunde bei Raumtemperatur.
Ersetzen Sie dann das Entwässerungsreagenz durch 400 Mikroliter absolutes Methanol und entwässern Sie das Gewebe über Nacht bei minus 20 Grad Celsius. Nachdem die Fixierung abgeschlossen ist, rehydrieren Sie das Gewebe in einer vierstufigen Reihe von abgestuften Rehydratationslösungen für 10 Minuten auf Eis. Waschen Sie dann die Taschentücher in 400 Mikrolitern PBST für 10 Minuten bei Raumtemperatur.
Inkubieren Sie das Gewebe in 400 Mikrolitern Proteinase-K-Lösung für 30 Minuten bei Raumtemperatur. Waschen Sie das Gewebe zweimal in 400 Mikrolitern PBST, um die enzymatische Verdauung zu stoppen. Nach der Zugabe des Postfixiermittels wird das Gewebe vor der Sondenhybridisierung erneut mit PBST gewaschen.
Tauchen Sie das Gewebe fünf Minuten lang in 400 Mikroliter Sondenhybridisierungspuffer. Als nächstes entfernen Sie den Puffer und hybridisieren das Gewebe in 400 Mikrolitern vorgewärmtem Sondenhybridisierungspuffer für 30 Minuten bei 37 Grad Celsius. Ersetzen Sie den vorgewärmten Sondenhybridisierungspuffer durch 400 Mikroliter erhitzte Sondenlösung.
Legen Sie die Tube für zwei Nächte bei 37 Grad Celsius in einen Nutator. Legen Sie dann den Nuttator in einen Inkubator, der in einer Schachtel abgedeckt ist. Als nächstes wird das Gewebe in 400 Mikroliter Sondenwaschpuffer bei 37 Grad Celsius im Inkubator nutiert.
Nach dem Waschen des Gewebes in 5x SSCT 10 Minuten lang bei Raumtemperatur in 400 Mikrolitern Amplifikationspuffer inkubieren. Pipettieren Sie den Amplifikationspuffer aus dem Röhrchen. Dann eine Mischung aus den erhitzten Haarnadeln H1 und H2 hinzufügen. Als nächstes pipettieren Sie 100 Mikroliter Amplifikationspuffer.
Nutenieren Sie das Gewebe über Nacht im Dunkeln bei Raumtemperatur. Um das Gewebe zu montieren, geben Sie zunächst fünf Tropfen Montagelösung auf einen Objektträger. Greifen Sie dann mit einer Pinzette die gewaschenen Gewebeproben an ihrer Basis.
Tauchen und spülen Sie vorsichtig in die Reihe der Tröpfchen der Montagelösung. Dann mit Montagelösung montieren und ein Deckglas über das Tuch legen. Versiegeln Sie das Deckglas vor der Bildgebung mit Nagellack.
HCR-Fiche-Analysen des Riechgewebes der weiblichen Anopheles-Mücke zeigten, dass IR 41t1, IR75d und IR7t in den Antennen weniger häufig vorkamen. IR64a war dreimal häufiger als die übrigen Kandidatengene. Kolokalisationen von Orco- und IR25a-Rezeptorfamilien wurden sowohl in der Antenne als auch im Oberkieferpalp der Mücke beobachtet.
Kolokalisationsmuster deuten darauf hin, dass IR76b-positive Zellen IR25a exprimieren, während IR8a-positive Zellen teilweise mit IR76b und IR25a kolokalisieren.
