Zu Beginn wird das frisch herausgeschnittene menschliche Omentum aus dem Auffangbehälter in einer Laminar-Flow-Haube entnommen. Tauchen Sie das Omentum in PBS, um Blutreste oder Ablagerungen vorsichtig abzuwaschen. Schneide das Gewebe mit einem Skalpell und einer Pinzette in Stücke.
Legen Sie die Omentumstücke in einzelne Vertiefungen einer 24-Well-Kulturplatte. Füllen Sie dann die Vertiefungen mit 500 Mikrolitern Omentum-Nährmedien. Geben Sie 10 Milliliter steriles PBS in eine Kulturflasche, die 75 % confluente menschliche mCherry-positive Eierstockkrebszellen enthält.
Schaukeln Sie den Kolben vorsichtig, um die Zellen zu waschen. Entfernen Sie das PBS und fügen Sie drei Milliliter 0,05%iges Trypsin EDTA hinzu. Schaukeln Sie den Kulturkolben erneut vorsichtig, um das Trypsin-EDTA gleichmäßig auf den anhaftenden Zellen zu verteilen.
Dann wird der Kolben für fünf Minuten bei 37 Grad Celsius und 5 % Kohlendioxid in einen Inkubator gestellt. Danach nehmen Sie den Kolben aus dem Inkubator. Klopfen Sie nun auf den Kulturkolben, um die Zellen vollständig abzulösen.
Fügen Sie dann drei Milliliter Omentum-Nährmedium hinzu, um das Trypsin zu neutralisieren. Pipettieren Sie die Zellsuspension mehrmals, um sie gut zu mischen. Die Suspension wird in ein konisches 15-Milliliter-Röhrchen überführt.
Die Suspension wird bei 1.200 g fünf Minuten lang bei 24 Grad Celsius zentrifugiert. Pipettieren Sie nun den Überstand heraus und resuspendieren Sie das Zellpellet in sechs Milliliter frischem Omentum-Nährmedium. Nehmen Sie 10 Mikroliter der Zellsuspension, um die Zellen mit einem Zellzähler zu zählen.
Verdünnen Sie die Zellsuspension mit frischen Nährmedien auf die erforderliche Dichte. Mit einer Ein-Milliliter-Spritze die Krebszellsuspension aufziehen. Befestigen Sie eine 26-Gauge-Nadel an der Spritze.
Nehmen Sie nun mit einer kleinen chirurgischen Pinzette ein Stück des geschnittenen Omentums auf und legen Sie das Omentumstück in eine separate, sterile Schale. Dann injizieren Sie etwa 100 Mikroliter der Krebszellsuspension in das Gewebe. Alternativ können gleiche Volumina der aufgetauten Basalmembranmatrix mit der Omentumkultur gemischt werden.
Die Mischung bis zur Injektion auf Eis legen. Nachdem Sie die Omentumstücke in die Matrixmischung in den Vertiefungen der Kulturplatte eingetaucht haben, inkubieren Sie die Platte 20 Minuten lang. Danach entfernen Sie die Platte aus dem Inkubator.
Sobald die Mischung fest geworden ist, injizieren Sie die Omentumstücke mit den Krebszellen. Bestätigen Sie die erfolgreiche Injektion der Krebszellen mittels Fluoreszenzbildgebung. Ein Streifen des Fluoreszenzsignals ist an den Injektionsstellen als Bestätigung zu sehen.
Um die Co-Kultur des Omentums und der Krebszellen zu erleichtern, fügen Sie alle 48 bis 72 Stunden 500 bis 200 Mikroliter frisches Medium hinzu. Überwachen Sie schließlich mit einem Fluoreszenzmikroskop das Wachstum von Eierstockkrebstumoren. Das Tumorwachstum kann innerhalb von zwei Wochen sichtbar sein.
Die Eierstockkrebszellen wurden am 14. Tag erfolgreich in die Omentumstücke integriert. Die Krebszellen breiten sich zunächst in der ersten Woche über die Omentumoberfläche aus. Im Laufe der Zeit sammelten sich die Zellen zu Tumoren.
Die Tumorlast wurde durch die Farbveränderung des Omentum media, das von rot nach gelb wechselte, bestätigt.
