Zu Beginn wird in einer Sechs-Well-Platte ein Milliliter menschlicher embryonaler Nierenzellen 293T ausgesät. Fügen Sie zwei Milliliter komplettes DMEM hinzu. Ersetzen Sie das Medium am nächsten Tag durch ein frisches, antibiotikafreies Medium, um die Zellen auf die Transfektion vorzubereiten.
Um die adhärenten Zellen zu transfizieren, bereiten Sie zunächst Mischung A vor, indem Sie Plasmid-DNA zu 100 Mikrolitern Opti-MEM hinzufügen. Als nächstes fügen Sie 17,5 Mikroliter Polyethylenimin zu 100 Mikrolitern Opti-MEM hinzu. Mischen Sie den Inhalt der Mischung A und B und inkubieren Sie dann.
Während der Inkubation schnippen Sie das Röhrchen alle drei bis vier Minuten vorsichtig, um das Mischen zu verbessern. Geben Sie das gesamte Volumen der Mischung auf den Teller mit den HEK 293T-Zellen. Nach 16 bis 20 Stunden Transfektion wird das Nährmedium durch frisches, vollständiges DMEM ersetzt.
Inkubieren Sie die Platte bei 37 Grad Celsius unter 5 % Kohlendioxid, um die Pseudotyp-Viren zu produzieren. Nach 72 Stunden Transfektion wird der Überstand in ein Sammelröhrchen geerntet. Der Überstand wird bei 1.600 g sieben Minuten lang bei Raumtemperatur zentrifugiert.
Anschließend filtriert der Überstand durch einen 0,45 Mikrometer großen Celluloseacetatfilter. Verteilen Sie 50 Mikroliter vollständiges DMEM in den Vertiefungen einer 96-Well-Platte. Lassen Sie Zeile A leer.
Geben Sie 100 Mikroliter des Pseudovirus-Stocks in die Vertiefungen in Reihe A.Als nächstes pipettieren Sie 50 Mikroliter der Lösung von Reihe A nach B.Wiederholen Sie diesen Vorgang bis zu Reihe G, um serielle Verdünnungen zu erhalten. Entfernen Sie das erschöpfte Medium von einer Platte mit kultivierten empfindlichen HEK 293T ACE2-Zellen und waschen Sie die Zellen mit vier Millilitern DPBS. Dann trennen Sie die Zellen mit einem Milliliter Trypsin-EDTA in DPBS-Kochsalzlösung.
Geben Sie nun 50 Mikroliter der empfänglichen Zellsuspension in jede Vertiefung, die die Pseudotyp-Viren enthält. Inkubieren Sie die Platte bei 37 Grad Celsius unter 5 % Kohlendioxid für 48 Stunden. Geben Sie 100 Mikroliter des Luciferase-Reagenzes in jede Vertiefung.
Nach der Inkubation wird der Inhalt jeder Vertiefung in eine schwarze 96-Well-Platte überführt. Lesen Sie dann die Platte in einem Plattenleser ab. Geben Sie in einer 96-Well-Platte 50 Mikroliter frisches vollständiges DMEM in die Spalten eins bis 10 von den Reihen B bis H.Geben Sie 95 Mikroliter frisches vollständiges DMEM in die entsprechenden Vertiefungen der Reihe A.Geben Sie nun 50 Mikroliter vollständiges DMEM in die Vertiefungen in Spalte 11 und 100 Mikroliter DMEM in Spalte 12.
Pipettieren Sie fünf Mikroliter hitzeinaktivierte Serumproben in Reihe A.Mit einer Mehrkanalpipette mischen Sie die Proben in der ersten Reihe und übertragen Sie 50 Mikroliter mediumhaltiges Serum von Reihe A nach B bis zur Reihe H.Verteilen Sie 50 Mikroliter verdünntes pseudovirushaltiges Medium auf jede Vertiefung von Spalte eins bis 11. Inkubieren Sie die Platte bei 37 Grad Celsius unter 5 % Kohlendioxid für eine Stunde. Bereiten Sie eine Suspension von empfindlichen HEK293T ACE2-Zellen in fünf Millilitern vor.
Geben Sie 50 Mikroliter der Zellsuspension in jede Vertiefung und inkubieren Sie dann, bevor Sie den Luciferase-Assay durchführen. Eine geringere Serumverdünnung führte zu einem verringerten Viruseintritt in die Zellen. Dies wird durch den erhöhten Prozentsatz der Neutralisation bestätigt.
