Geben Sie zunächst 500 Mikroliter warmes Kulturgel in eine Vertiefung in einer 24-Well-Platte. Übertragen Sie die präparierten ganzen Schneidezähne, isoliert von der Maus, schnell in die Vertiefung. Schwenken Sie die Platte einige Male, um die Schneidezähne zu spülen.
Geben Sie 400 Mikroliter warmes Kulturgel in eine Kulturschale und übertragen Sie die gespülten Schneidezähne in die Schale. Richten Sie den Schneidezahn aus, um den Bereich der Halswirbelschleife in der Mitte der Schale zu positionieren, und passen Sie die Neigung des apikalen Schneidezahns an die gewünschte Abbildungsebene an. Sobald das Gel ausgehärtet ist, entfernen Sie mit einer feinen Pinzette das Gel auf der gewünschten Region.
Geben Sie etwa 150 Mikroliter warmes Nährmedium gegen den Rand der Schale, um die Probe zu bedecken. Platzieren Sie die Explantatkultur bei 37 Grad Celsius, damit sich das Gewebe absetzen kann. Schalten Sie nach einer Stunde das Mikroskop und den Zwei-Photonen-Laser ein.
Befestigen Sie die Kulturschale am Bühnenadapter und setzen Sie den Profusionsadapterring darauf. Schließen Sie den Tischadapter an einen Temperaturregler an, um die Kultur auf 37 Grad Celsius zu halten. Verbinden Sie den Einlass und den Auslass des Adapterrings mit einer Mikroprofusionspumpe.
Stellen Sie die Profusionsgeschwindigkeit auf 20 ein und leiten Sie die Profusion des Mediums über die Probe ein. Platzieren Sie einen ACBR auf dem Adapterring und heben Sie den Tisch an, so dass das Objektiv durch den ACBR passt, um Kontakt mit dem Nährmedium herzustellen. Drehen Sie die Laserwellenlänge auf 920 Nanometer, um GFP zu visualisieren.
Nachdem Sie die Probe durch ein Okular lokalisiert haben, visualisieren Sie sie mit einer Mikroskopsoftware und stellen Sie dann eine Z-Schrittweite von vier Mikrometern und ein Zeitintervall von fünf Minuten für 14 Stunden ein. Initiieren Sie die Zeitrafferaufnahme und speichern Sie die nachfolgenden Dateien für die nachgelagerte Datenanalyse. In der Zeitraffer-Mikroskopie des K14-Cre; R26-rtTA; tetO-H2B-GFP zervikale Schleife wurden die H2B-GFP-Signale überwiegend in der trans-amplifizierenden Region der zervikalen Schleife beobachtet, was auf aktive Zellteilungen hindeutet.
Des Weiteren wurde die Kondensation und Ausrichtung von Chromosomen an der Metaphasenplatte in mitotischen Zellen beobachtet, gefolgt von ihrer Segregation während der Anaphase und in zwei Tochterzellen. Die meisten Zellteilungen erfolgten senkrecht oder in einem schrägen Winkel zur Basalmembran mit weniger horizontalen Teilungen parallel zur Basalmembran. Zellteilungsereignisse waren auch in K14-Cre zu beobachten; R26-mT/mG zervikale Schleifen, bei denen alle Epithelzellmembranen grün markiert waren.
Mitotische Zellen wurden durch ihre Zellrundung und anschließende Zytokinese identifiziert. In K14-Cre; R26-mT/mG-Zervixschleifen, sowohl horizontale als auch vertikale Zellteilungen wurden ebenfalls beobachtet.
