Obtaining Wildtype and Transgenic Zebrafish Larvae and WildType Whole Larvae Dissociation

Beginnen Sie mit der Gewinnung der Wildtyp- und transgenen Zebrafischeier aus dem jeweiligen Zuchtaufbau. Nehmen Sie eine 15 Zentimeter lange Petrischale, die HEPES-gepuffertes E3-Medium oder E3 enthält. Und sammeln Sie die entsprechende Menge an befruchteten Eiern aus der gewünschten Zebrafisch-Zuchtanlage. Bebrüten Sie die befruchteten Eier in E3 bei 28 Grad Celsius mit einem geeigneten Hell-Dunkel-Zyklus.

Einen Tag nach der Befruchtung oder dpf entfernen Sie alle unbefruchteten Eizellen und lassen Sie die befruchteten Eizellen bis fünf dpf entwickeln. Selektieren Sie die transgenen Zebrafischlarven mit einem dpf. Bevor Sie mit der Dissoziation ganzer Larven fortfahren, werden die fünf dpf-Wildtyp-Larven mit 0,016 % Tricain anästhesiert und 30 betäubte Larven in eine Petrischale mit einem Milliliter 10-facher Trypsin-EDTA-Lösung überführt.

Anschließend die Larven mit einer Rasierklinge in der Petrischale in kleine Stücke schneiden. Die zerkleinerten Larven werden in ein Mikrozentrifugenröhrchen mit zwei Millilitern 10-facher Trypsin-EDTA-Lösung gegeben und drei Stunden lang auf Eis gelassen. Pipettieren Sie den Inhalt stündlich mit einer P1000-Pipette auf und ab, um die Dissoziation zu stimulieren.