Bereiten Sie zunächst eine 1,8%ige Agaroseplatte mit HEPES-gepuffertem E3-Medium oder E3 vor. Während Sie unter einem Präpariermikroskop arbeiten, legen Sie sechs bis 10 betäubte Larven in einer Reihe auf die Agaroseplatte. Setze jeder Larve eine Insektennadel auf den Kopf. Entfernen Sie dann das restliche E3 mit einem Taschentuch von der Platte.
Isolieren Sie mit einem weiteren Insektenstift den Darm von einer Larve, ohne andere Organe zu stören. Achten Sie auf eine ordnungsgemäße Entfernung des Eigelbs. Nach der Isolierung inspizieren Sie den Darm und entfernen Sie sämtliches Nicht-Darmmaterial wie Haut, Fett oder Leber.
Verwenden Sie eine Pinzette, um den Darm aufzufangen und in ein Mikrozentrifugenröhrchen auf Eis zu übertragen, das 10 % FCS enthält. Unmittelbar nach der Dissektion des gesamten Darms zentrifugieren Sie das Mikrozentrifugenröhrchen 30 Sekunden lang bei 13.800 g. Entfernen Sie den Überstand und lassen Sie etwa 100 Mikroliter im Röhrchen, um ein Austrocknen des Darms zu verhindern.
Geben Sie 500 Mikroliter Papainlösung in den Darm in das Röhrchen. Aktivieren Sie das Papain, indem Sie 2,5 Mikroliter eines molaren Cysteins hinzufügen. Anschließend das Röhrchen mit dem Darm in einem Wasserbad bei 37 Grad Celsius für 10 Minuten inkubieren.
Pirigieren Sie den Inhalt nach fünf Minuten zur Hälfte auf und ab, um die Verdauung des enzymatischen Gewebes anzuregen. Die dissoziierten Zellen werden durch ein vorgefertigtes 35-Mikron-Zellsieb in ein fluoreszenzaktiviertes Zellsortierröhrchen (FACS) überführt. Waschen Sie das Sieb mehrmals, indem Sie 0,5 Milliliter PBS mit 10 % FCS zu einem Gesamtwaschvolumen von zwei Millilitern hinzufügen.
Das gesammelte Filtrat wird bei 700 g fünf Minuten bei 4 Grad Celsius zentrifugiert und der Überstand entfernt. Ein Mikrogramm pro Milliliter DAPI wird zu 300 Mikrolitern PBS mit 10 % FCS hinzugefügt. Fügen Sie diese Mischung dem Pellet hinzu und resuspendieren Sie, um die abgestorbenen Zellen zu markieren.
Anschließend fünf Minuten lang auf Eis inkubieren, damit sie bei der anschließenden FACS-Analyse ausgeschlossen werden können.
