Hepatocellular Carcinoma Tissue Dissociation for Organoid Culture

Um mit der Gewebedissoziation zu beginnen, werden ein bis zwei Kubikzentimeter hepatozelluläres Karzinom oder HTC-Gewebe von unbehandelten Patienten entnommen. Dann legen Sie das Gewebe in die Gewebekonservierungslösung und halten Sie es bis zur Verarbeitung bei vier Grad Celsius. Heizen Sie nun die Zellkulturplatten mit extrem niedriger Anhaftungsfläche für eine Stunde in einem auf 37 Grad Celsius eingestellten Inkubator vor.

Den Basalmembranextrakt über Nacht bei vier Grad Celsius auftauen. Schneiden Sie das Tumorgewebe mit einer chirurgischen Schere auf einer Petrischale in einer Laminar-Flow-Haube in kleine Stücke. Füllen Sie diese Stücke in ein konisches 15-Milliliter-Röhrchen und fügen Sie fünf bis 10 Milliliter Basalmedium hinzu.

Waschen Sie mit einer barotropen Pipette so viel Blut wie möglich ab. Lassen Sie die Mischung ein bis zwei Minuten ruhen, bevor Sie einen Teil des Überstandes entfernen, einschließlich aller Blutzellen und schwimmenden Fettgerinnsel. Anschließend zentrifugieren Sie die Mischung bei 300 G fünf Minuten lang bei Raumtemperatur.

Anschließend wird der Überstand vorsichtig extrahiert und fünf Milliliter vorgewärmte Aufschlusslösung in das abgeschnittene Gewebe gegeben. Platzieren Sie das Röhrchen bei 37 Grad Celsius in einem Rotor, um einen optimalen Aufschluss zu erzielen. Nach 30 Minuten anfänglicher Verdauung mit einem Mikroskop nach kleinen Zellclustern suchen.

Um die Verdauung zu stoppen, geben Sie fünf Milliliter kaltes Basalmedium in das Röhrchen. Anschließend mit einem 100-Mikrometer-Zellfilter in ein neues 50-Milliliter-Röhrchen sieben. Füllen Sie das Röhrchen mit kaltem Basalmedium, um ein Gesamtvolumen von 50 Millilitern zu erreichen.

Anschließend zentrifugieren Sie die Zellen bei zwei G für 10 Minuten bei acht Grad Celsius. Wenn Sie fertig sind, entfernen Sie vorsichtig die überstehende Flüssigkeit. Resuspendieren Sie das Pellet in 50 Milliliter kaltem Basalmedium, um das Zellpellet für die Organoidbeschichtung zu erhalten.