Um eine Organoid-Plattierung durchzuführen, wird zunächst der Überstand aus der Zentrifuge entfernt und die hepatozellulären Karzinomzellen gewaschen. Resuspendieren Sie die Zellen in den 50 Mikrolitern Basalmembranextrakt (BME) pro Vertiefung für die Beschichtung. Suspendieren Sie als Nächstes die Zellen in Advanced DMEM/F12.
Dann werden die Zellaggregate vorsichtig pipettiert, bis eine gleichmäßige Suspension zu sehen ist. Fügen Sie der Suspension BME hinzu und stellen Sie sicher, dass die BME-Konzentration zwischen 30 und 50 % liegtSäen Sie nun 50 Mikroliter BME-Tröpfchen mit Zellclustern in der Mitte einer 24-Well-Platte. Die Tröpfchen bei 37 Grad Celsius 20 Minuten erstarren lassen.
Geben Sie 500 Mikroliter vorgewärmtes Medium in jede Vertiefung und inkubieren Sie in einem Zellinkubator bei 37 Grad Celsius. Aktualisieren Sie das Nährmedium alle zwei bis drei Tage. Ersetzen Sie nach zwei Wochen das Isolationsmedium durch das organoide Expansionsmedium.
Nach sieben bis 10 Tagen der Kultivierung, sobald die Organoide die entsprechende Dichte erreicht haben, werden die Kulturen nach Bedarf verarbeitet. Um die Organoide zu passieren, werden zunächst Zellkulturplatten mit extrem niedriger Anhaftungsfläche in einem Inkubator vorgewärmt. Anschließend tauen Sie den gefrorenen BME über Nacht bei vier Grad Celsius bis kurz vor der Verwendung auf.
Die organoide Erntelösung und den Trypsinersatz 30 Minuten lang auf 37 Grad Celsius vorwärmen. Nach der Vorbereitungsphase wird das Nährmedium von der organoiden Kulturplatte entfernt. Anschließend wird die Organoid-Suspension in ein 15-Milliliter-Röhrchen überführt.
Geben Sie nun eine Organoid-Erntelösung im Verhältnis zur BME-Menge hinzu. Um die Suspension zu mischen, verwenden Sie eine 1000-Mikroliter-Pipettenpistole, um sie auf und ab zu kratzen und zu pipettieren. Nachdem Sie das Röhrchen 30 Minuten lang bei Raumtemperatur inkubiert haben, verwenden Sie eine Ein-Milliliter-Pipette, um den BME vorsichtig abzusaugen.
Stellen Sie sicher, dass der BME vollständig aufgelöst ist. Überwachen Sie den Extrakt alle 10 Minuten, bis ein klarer organoider Zellhaufen sichtbar ist. Anschließend bei Raumtemperatur bei 400 g fünf Minuten zentrifugieren.
Entferne so viel Überstand wie möglich. Um die enzymatische Verdauung der hepatozellulären Karzinom-Organoide zu starten, fügen Sie dem kultivierten Organoid-Pellet ein bis fünf Milliliter des vorgewärmten Trypsinersatzes hinzu. Inkubieren Sie die Suspension zwei Minuten lang bei 37 Grad Celsius.
Verwenden Sie ein Mikroskop, um zu überprüfen, ob Organoide in kleine Cluster von zwei bis 10 Zellen dissoziieren. Um die Verdauung zu stoppen, fügen Sie eine angemessene Menge kaltes Basalmedium hinzu. Anschließend zentrifugieren Sie die Organoide bei 400 g für fünf Minuten bei acht Grad Celsius.
Entfernen Sie vorsichtig so viel Überstand wie möglich. Resuspendieren Sie die gewünschte Anzahl von Organoiden in der richtigen Matrix für die Beschichtung. Alle 10 Tage passieren die Organoide, abhängig von der Dichte des Organoidwachstums.
HCC-Organoide Sphäroide wurden innerhalb von drei Tagen nach der Kultur beobachtet. Kompakte Sphäroide mit abgerundeten Kanten und durchlässigem Zytosol wurden am ersten Tag der Etablierung gesehen. Organoide waren ähnlich groß und hatten den größten Durchmesser, wenn sie in 30 bis 50 % BME kultiviert wurden.
Der BME war mit 10 % am stärksten fragmentiert, was zu den kleinsten Organoiden führte. Die BME war mit 100 % am intaktesten, führte aber zu Organoiden mit mittlerem Durchmesser. Das proliferierende HCC-Organoid erreichte nach drei Generationen in jeder Kultur eine Größe von über 500 Mikrometern.
HCC-Organoide mit einer Größe von mehr als 1000 Mikrometern wurden innerhalb einer Kulturperiode von 20 Tagen erhalten.
