Verwenden Sie zunächst eine Pinzette, um Fett und Bindegewebe aus der präparierten submandibulären Speicheldrüse einer euthanasierten Maus zu entfernen. Legen Sie dann die Stopfbuchse in ein Sammelröhrchen mit eiskalter HBSS-Lösung. Als nächstes schneidest du die Drüse mit einer Pinzette in ein Quadrat von einem Zentimeter große Stücke.
4%ige Agarose auf 50 Grad Celsius erhitzen und die Lösung in eine 35-Millimeter-Schale gießen. Gießen Sie eine kleine Menge der Agaroselösung in eine separate Schale und geben Sie die Drüsenstücke hinein. Dann schwenken Sie die Stücke in der überschüssigen Agarose, um sie zu beschichten.
Als nächstes vier bis sechs Stücke der Drüse flach in die erste Schale mit Agarose legen. Legen Sie den Deckel auf die Schale und geben Sie sie in eine Eisbox, bedecken Sie die Platte mit Eis, um sie abzukühlen und fest werden zu lassen. Um die Drüsenstücke zu trennen, schneiden Sie zunächst mit einem Skalpell vorsichtig um den in der Drüse eingebetteten Agaroseblock herum.
Tragen Sie als Nächstes einen Tropfen Sekundenkleber auf den Agaroseblock auf und befestigen Sie ihn an der Bühne eines Vibratoms. Füllen Sie nun die Vibratomkammer mit eiskaltem PBS mit 1%Penicillin-Streptomycin. Schneiden Sie mit einem Skalpell überschüssige Agarose ab und schaffen Sie fünf Millimeter Lücken zwischen den einzelnen Drüsenstücken.
Richten Sie die Vibratomklinge am Agaroseblock aus und legen Sie die Start- und Endpunkte der Abschnitte fest. Schneiden Sie den Gewebeblock mit niedriger Geschwindigkeit und hoher Vibration in 150 Mikrometer dicke Abschnitte. Sobald die Abschnitte geschnitten sind, nehmen Sie die Scheiben mit einem Pinsel auf und legen Sie sie in eine Schale mit vorgewärmtem RPMI-Medium, das die Antibiotika enthält.
Um die submandibulären Schichten zu kultivieren, geben Sie zunächst 1,5 Milliliter RPMI-Medien in die Vertiefungen einer Sechs-Well-Platte. Platzieren Sie 0,4-Mikrometer-Filter in den Vertiefungen. Anschließend mit Hilfe eines Pinsels vorsichtig ein bis sechs Scheiben auf jeden Filter übertragen.
Anschließend wird die Platte bei 37 Grad Celsius unter 5 % Kohlendioxid inkubiert. Nachdem Sie einige Versuchsplatten mit Gammastrahlung bestrahlt haben, um Verletzungen hervorzurufen, legen Sie die Platten wieder in den Inkubator zurück. Als nächstes füllen Sie die Vertiefungen einer 24-Well-Platte mit 500 Mikrolitern Nährmedien.
Heben Sie die Scheiben mit einem Pinsel aus dem Filter und tauchen Sie sie vorsichtig in die Vertiefungen. Inkubieren Sie die Scheiben in den entsprechenden Kernfärbungen. Anschließend werden die Scheiben zwei Stunden lang bei 37 Grad Celsius unter leichtem Rühren mit Antikörpern inkubiert.
Tauchen Sie die Scheiben dreimal in Nährmedien, um sie zu waschen. Lassen Sie die Scheiben in jeder Waschlösung 10 Minuten bei Raumtemperatur unter leichtem Rühren inkubieren. Als nächstes entfernst du mit einer Pinzette das Klebeband von einem doppelseitigen Abstandshalter.
Kleben Sie den Abstandshalter auf den Boden einer Sechs-Well-Platte mit Glasboden und pipettieren Sie dann 50 Mikroliter Medien in den Spalt in der Mitte des Abstandshalters. Legen Sie die Scheibe in das Medium und achten Sie darauf, dass sie flach aufliegt. Entfernen Sie dann mit einer Pipette vorsichtig 20 Mikroliter des Mediums aus dem Spalt.
Entfernen Sie das Klebeband vorsichtig mit einer Pinzette von der Oberseite des Abstandshalters und legen Sie ein 25 Millimeter kreisförmiges Deckglas darüber. Drücken Sie die Kanten des Abstandshalters um, um eine feste Haftung des Deckglases zu gewährleisten. Bilden Sie die Schicht auf einem konfokalen Mikroskop ab.
Nicht bestrahlte Schnitte der submandibulären Drüse, die sieben Tage lang kultiviert wurden, behielten ihr MT-Signal und ihre Epithelarchitektur. Drei Tage nach der Bestrahlung wurde jedoch eine Atrophie der azinären und duktalen Zellen beobachtet. Caspase-positive Zellen wurden vier Tage nach der Bestrahlung beobachtet.
In bestrahlten Schnitten wurde ein erhöhter Gamma-H2AX-Gehalt beobachtet, was auf eine in vivo DNA-Schädigung hindeutet. Die Echtzeit-Bildgebung von Makrophagen bestätigte die Phagozytose von Epithelzellen im Schnittkulturmodell. Einzelne Zellen können erkannt und segmentiert werden, um anschließend das Zellverhalten, wie z. B. die Migration, zu analysieren.
