Zu Beginn spülen Sie die Drosophila-Larven im L3-Stadium dreimal für jeweils fünf Minuten in kaltem PBS. Halten Sie mit zwei scharfen Pinzetten den vorderen Teil der Larven fest und entfernen Sie etwa 2/3 des Körpergewebes. Halten Sie das erste 1/3 der Larven mit einer Pinzette und Mundhaken mit dem anderen Paar fest.
Ziehen Sie dann die Maulhaken im Inneren der Larven zurück, bis die Larven vollständig umgedreht sind. Entfernen Sie die Beinscheiben und das Gehirn, um einen sauberen, invertierten Larvenkadaver mit einem Paar Flügelscheiben an der Luftröhre zu erhalten. Die Flügelscheiben in ein Ein-Milliliter-Zentrifugenröhrchen überführen.
Fixieren Sie die Flügelscheiben in 4%igem Paraformaldehyd, verdünnt in PBS für 45 Minuten bei Raumtemperatur unter Rühren. Nach der Fixierung werden die Proben dreimal für jeweils fünf Minuten mit 70%igem Ethanol gewaschen. Entfernen Sie die Köpfe, Bauch, Beine und Flügel von den betäubten Fliegen und legen Sie die präparierten Thorax in kaltes PBS.
Dem Thorax wird 4%Paraformaldehyd, verdünnt in 1%Triton, für 20 Minuten unter Rühren vorangestellt. Waschen Sie die Proben dann dreimal für jeweils fünf Minuten mit PBT unter Rühren. Positionieren Sie die Thoraxe auf einem doppelseitigen Klebeband auf einem Objektträger und halbieren Sie sie mit einer scharfen Mikrotomklinge, um zwei Hemithoraxe zu erzeugen.
Fixieren Sie die Hemithoraces in 4%igem Paraformaldehyd für 45 Minuten unter Rühren. Waschen Sie die Proben zweimal für jeweils 20 Minuten mit PBT unter Rühren. Legen Sie die Hemithoraces in kaltes PBS und isolieren Sie mit einer Pinzette vorsichtig die indirekten Flugmuskeln von den Hemithoraces.
Permeabilisieren Sie die Muskeln in 70%igem Ethanol für zwei bis sieben Tage bei vier Grad Celsius. Nach der Permeabilisierung werden die IFMs zweimal für jeweils 20 Minuten mit Puffer A gewaschen, dann 400 Mikroliter des Hybridisierungspuffers zugegeben und die Muskeln für 30 Minuten bei 37 Grad Celsius in einem Thermomischer vorhybridisiert. Fügen Sie 100 Mikroliter frisch zubereiteten Hybridisierungspuffer hinzu, der die Sonde und den primären Antikörper enthält.
Inkubieren Sie die Proben im Dunkeln bei 37 Grad Celsius für 16 Stunden bei 300 U/min in einem thermischen Mischer. Nach der Inkubation werden die Proben dreimal mit warmem Puffer A für jeweils 10 Minuten gewaschen. Anschließend werden die Proben eine Stunde lang in Sekundärantikörper und DAPI, verdünnt in Puffer A, bei 37 Grad Celsius inkubiert.
Waschen Sie die Proben dreimal mit Puffer B für jeweils 20 Minuten, bevor Sie sie auf einen Objektträger übertragen. Wischen Sie den Restpuffer B ab und geben Sie 30 Mikroliter Eindeckmedium auf den Objektträger. Legen Sie ein 18 x 18 Millimeter großes Deckglas auf den Objektträger und versiegeln Sie das Deckglas mit Nagellack.
